Ведущие методические проблемы в бактериологических исследованиях и новые подходы.

к.б.н. Афонюшкин В.Н., сектор болезней птиц ГНУ ИЭВСиДВ, к.в.н. Коптев В.Ю. СибАгроТрейд,

Рассмотрим основные проблемы связанные с бактериальной патологией в птицеводстве.

 

1.     Сложность точного определения роли выявленного микроорганизма в нанесении экономического ущерба птицефабрике.

2.     Вопросы адаптации возбудителей инфекционных заболеваний к мерам противодействия как со стороны организма птицы, так и со стороны ветеринарного врача

Сегодня нельзя утверждать, что все эти вопросы уже решены, но, на наш взгляд, некоторые пути их решения уже определены современной наукой, поэтому врачам-практикам стоит начать процесс усвоения новых методов диагностики и научится работать с полученными данными.

Наш сектор, ввиду технической оснащенности и методологической изощренности, сегодня координирует работу научной группы, занимающееся исследованиями бактериальной патологии на молекулярном и клеточном уровне, разработкой механизмов борьбы с антибиотикорезистентностью бактерий, механизмов действия пробиотиков.

Сложность определения роли того или иного микроорганизма в развитии патологии обусловлена тем, что патогенность бактерий одного и того же вида сильно варьирует, чрезвычайно широко распространено бессимптомное носительство. Один и тот же штамм микроорганизма по разному способен действовать на организм птицы в зависимости от иммунного статуса, состава микробиоценоза кишечника или респираторной системы, местной резистентности, напряженности специфического иммунитета, сопутствующих инфекций и инвазий.

В связи с этим триада Коха - выделить микроорганизм в чистом виде, воспроизвести патологию на восприимчивом животном и выделить при этом  того же возбудителя, не всегда бывает эффективной. Помимо этого время затрачиваемое на реализацию такого диагностического алгоритма может равняться сроку вымирания значительной поголовья какого-нибудь корпуса птицефабрики от высококонтагиозной инфекции.

С другой стороны остро-протекающая инфекция приводящая к летальному исходу для возбудителя инфекции не выгодна в эволюционном аспекте. Острое течение болезни не приводящее к гибели, так же не выгодно, ибо часто сопровождается не менее активным и напряженным специфическим иммунным ответом. Поэтому наиболее устойчивая форма сосуществования системы паразит-хозяин это персистенция - бессимптомное носительство, латентное течение инфекции или же хроническое. И мы этот процесс регулярно наблюдаем на практике – даже высоко-патогенные формы бактерий приводят к гибели слабой птицы, а у большей части поголовья могут никак себя не проявлять, либо ограничиваться снижением продуктивности птицы.

Из этого не следует, что бороться с такими микробами не нужно, как раз способность к подавлению или обману защитных систем организма определяет в т.ч. и степень экономического ущерба.

     Какие это механизмы?

Активное разрушение ряда гуморальных защитных факторов: комплемента, иммуноглобулина А, лизоцима

Цитотоксические эффекты в отношении иммунокомпетентных клеток (и не только).

Высокая антигенная изменчивость, маскировка антигена (когда бактерия есть, а вакцина на нее не работает, или в серологических тестах она не выявляется)

Переход в L-форму

Индукция иммунотолерантности

Поэтому сегодня типирование у бактерий этих свойств становится актуальным, и соответствующие тесты разработаны.

 

Проблемы чувствительности и специфичности бактериологических исследований. Неверная оценка результатов бактериологического исследования, не обусловленная человеческим фактором, может быть вызвана следующими причинами:

1.   Переход бактерии в некультивируемое состояние (близкое к анабиозу) при пересеве или в организме.

2.   Более низкая способность патогенного микроорганизма расти на питательных средах и маскировка оного быстрорастущими микроорганизмами

3.   Активизация бактериофага (вируса бактерий) в ответ на изменение условий культивирования (в этом случае патогенные бактерии могут лизироватся).

4.     Патогенный изолят может быть ауксотрофным по какому либо питательному элементу (то есть неспособным самостоятельно усваивать какое либо вещество и растущим только в  присутствии бактерий обладающих соответствующими ферментативными системами). В этом случае чистая культура не может быть получена в принципе, по причине не возможности самостоятельного роста на обычных питательных средах.

 

 

Одним из наиболее удобных методов как для типирования изолятов на наличие факторов противодействия иммунной системе, так и для индикации факторов патогенности является безусловно ПЦР (полимеразная цепная реакция). И как, вы уже поняли, вышеперечисленные причины, осложняющие классические бактериологические исследования, для ПЦР абсолютно не  принципиальны.

Опыт использования ПЦР для индикации возбудителей инфекций в патологическом материале, сразу показывает, насколько низка чувствительность стандартных бактериологических исследований.

И при интерпретации данных ПЦР, как правило, речь уже не идет о наличии того или иного микроорганизма. При высокой чувствительности метода, та же сальмонелла обнаруживается на любой птицефабрике, вопрос лишь в проценте инфицированности, коррелляции с патологическими процессами, маркерах патогенности.

     Таким образом, другое преимущество ПЦР – массовость. Например поставив 800 реакций: с целью изучения наличия в патологическом материале, пробах крови, ДНК E.coli  с различными маркерами патогенности (TS, TL, VT1, VT2), ДНК сальмонеллы мы затратили около 5 дней рабочего времени. Бактериологическое исследование с выделением вышеперечисленных микроорганизмов из каждой пробы, биохимических исследований каждого изолята, типирования каждого изолята возбудителя на маркеры патогенности потребовало бы более 3 тысяч чашек Петри с различными средвами, и еще большее количество систем биохимической идентификации бактерий. Закономерно, что, в условиях практики, классическими методами бактериологии в принципе нельзя провести такие исследования.

    

Закономерен вопрос – зачем тратить на это деньги?

Для ответа на заданный вопрос рассмотрим современные постулаты определяющие роль микроорганизма в развитии патологии по Taylor-Robinson, Furr, 1997.

1)     Частота выделения микроорганизма от группы больных выше, чем от контрольной группы

2)     Микроорганизмов данного вида от больных выделяется больше, чем от здоровых

3)     У переболевших в крови наблюдаются антитела, причем их количество больше, чем у здоровых

4)     Имеется клиническая реакция на антибиотик, к которому чувствителен данный микроорганизм

5)     Введение данного микроба здоровому животному, или птице позволяет воспроизвести заболевания (триада Коха).

6)     Специфические антитела  (иммунизация) защищает от данного заболевания.

В принципе любой из этих критериев может служить диагностическим признаком и основанием для проведения специфических мероприятий. Но в любом из критериев используется статистический подход – выявление связи между патологией и бактерией. Таким образом, необходимо исследовать группы птиц с разным клиническим статусом, или из разных корпусов с различной эпизоотической ситуацией.

В связи с этим, наша лаборатория совместно с ООО  «СибАгротТрейд» сформировала группу специалистов, подобрала оборудование позволяющее подходить к проблемам бактериальной этиологии именно с этих позиций.

И реализуя комплексный подход, в сочетании с массовостью исследований мы работаем по следующим направлениям

•          Серологические исследования (ИФА).

•          Бактериологические исследования.

•          Токсикологические исследования кормов и их компонентов (ИФА)- как фактор снижающий резистентность.

•          Генноинжинерные исследования, ПЦР.

•          Биохимические исследования сыворотки крови – как маркер патологии и анализ распространенности патологии в стадах птицы.

•          Гистологические исследования – анализ взаимосвязи локализации в органах определенных форм бактерий и патологии, расшифровка механизмов патогенеза.

•          Эпизоотологические исследования

 

Рассмотрим, как можно комплексно подойти к выявлению роли, например эшерихии в развитии некоей патологии.

Вариант 1 Вы отобрали материал от павшей от данной болезни птицы и прислали его нам. Если, поставив ПЦР со всеми пробами у какой-то птицы E.coli не выявлена, можно будет поставить под сомнение ее роль в развитии патологии.

Вариант 2 Вы отослали материал от птицы из неблагополучного корпуса, и как контроль столько же проб от птицы из благополучного корпуса (например, кровь). В этом случае количество проб должно быть достаточным, для достоверной оценки частоты встречаемости E.coli в благополучном и неблагополучном стадах, (если заболеваемость 5 % то 10 проб, если 1% - 25 – 30 проб и т.д.)

 

Клиническая биохимия в ИФА формате:

Далеко не каждая заболевшая птица гибнет, нередко компенсаторные возможности пораженных органов позволяют уцелеть птице, и дело ограничится падением продуктивности. Таким образом патологоанатомический контроль заболевания отражает ситуацию лишь части поголовья в состав которого входит птица со сниженными адаптационными возможностями. Между тем, использование методов клинической биохимии в ИФА – формате, позволяет оценить распространенность патологии того или иного органа, расшифровать цепочку биохимических сдвигов приводящих к снижению продуктивности и скорректировать рационы, средства неспецифической терапии и т.д.

Например, креатинин отражает нарушение фильтрационной способности почек, АЛТ – разрушение печени, альбумин – нарушение синтетической функции печени, снижение эффективности гуморального ответа может быть обусловлено потерей гаммаглобулинов при протеинурии – соответственно определение уровня гамма-глобулинов при снижении титров антител может быть необходимым.

 

Рассмотрим новые тесты которые могут быть использованы на самих птицефабриках.

 

АТФ мониторинг гигиены

Аденозин трифосфат – универсальный источник энергии используемый как бактериями, так и многоклеточными организмами. Поэтому его детекция в различных объектах окружающей среды свидетельствует о наличии клеток или продуктов их распада.

 

АТФ разрешает произвести быстрый анализ поверхностей и жидкостей, которые могут быть биологически опасными.

 

Быстрый АТФ мониторинг предполагает несколько важных  преимуществ перед другими методами оценки:

1.       Мониторинг в реальном времени – реакция люциферин/люциферазы и АТФ происходит мгновенно и результаты можно получить  через несколько секунд. Это дает возможность быстро принимать решения и деиствовать.

2.       Достоверность и постоянство  - система обнаруживает органические остатки (живые клетки любого происхождения) и микроорганизмы.  А также  в системе используются жидкие реагенты, таким образом получаемые результаты достоверные и точные.

3.       Оценка непосредственого и косвенного риска – в момент теста  проверяется биологоческий материал (любого происхождения) на поверхностях,  как область риска  в которой есть биологические остатки, являющиеся  источником питания микробов. На поверхностях где присутствуют остатки продуктов быстрее происходит микробиологическое загрязнение.

4.       Удобны в использовании  - люминометр, тампоны и программа приспособлена  не только для квалифицированного персонала, поэтому  эту систему  можно использовать всем и ежедневно.

5.       Легко итерпретируется – результаты измерения показывает условными единицами света (RLU), которые зависят от контаминации исследуемой пробы.  Примерное отношение  -  1 условная единица света   с  10 ˉ¹5 моль АТФ.

6.       Результаты могут быть сразу причислены к  положительным,  предупреждающим, опасным уровням.       

 

 

АТФ мониторинг гигиены

 

• Гарантирует безопасность продуктов питания  и необходимую гигиену от места производства до употребления.
• Основа программы ХАССП -  исполнение гигиенических норм работниками  пищевой промышленности и чистота среды на производстве.
• Он используется в разнообразных областях пищевой промышленности, где проверка до этого времени была сложной, и там где необходим  быстрый ответ, напр.: проверка тары,  руки и спецодежда работников, проверка линии разлива и т.п.

 

 

ЛАЛ-тест основан на выявлении специфических для бактерий вообще молекул обладающих пирогенной активностью (липополисахаридов). Применяется в основном для оценки бактериальной загрязненности инъекционных препаратов – они могут оставаться стерильными, но содержать токсичные продукты распада бактериальных клеток.

 

 

Тест-пластинки Ридакоунт –представляют собой квадратики бумаги пропитанной реактивами изменяющими цвет в процессе роста бактерий. Существуют пластины предназначенные для определения бактериальной обсемененности сальмонеллой, микроорганизмами коли-группы, дрожжами,

 

Мобильные лаборатории

Современные технологии позволили в значительной мере миниатюризировать многие тесты: например прибор для определения загрязненности помещений органическими субстратами легко размещается в руке, появилась масса переносных детекторов влажности, температуры, освещенности. Заслуживают внимания биохимические анализаторы (нередко размером с сигаретную пачку) например анализатор глюкозы (себестоимость определения глюкозы составляет 50 копеек, для точного определения уровня глюкозы достаточно непосредственно в условиях птичника проткнуть иглой вену и поднести капилляр датчика к капле, в течение минуты данные будут выведены на экран и сохранены в памяти устройства). Существуют приборы для одновременного определения уровня углекислого газа и кислорода, натрия, калия, кальция и т.д. Размеры таких приборов также незначительны, от врача требуется только нанести на картридж каплю крови. Большая часть таких приборов сохраняет данные и позволяет перенести их в компьютер.

 

 

Перспективы создания ИФА лаборатории

В современной лабораторной диагностике наблюдается отчетливая тенденция все более широкого использования ИФА анализаторов, использования ИФА формата для новых тестов. Уже сегодня широко распространена биохимия в ИФА формате, в планшетах выращивают бактериальные клетки, ставят химические реакции, ПЦР, молекулярную гибридизацию и многое другое. С другой стороны, регулярно отправляя сыворотку на исследования в крупные диагностические центры, многие врачи-практики научились анализировать данные ИФА. Таким образом, приобретая ИФА лабораторию, птицефабрика получает массу преимуществ:

Во-первых, врач птицефабрики обладает максимально полной информацией о своей птице, поэтому и данные иммуноферментного анализа (научившись конечно) он обработает максимально эффективно.

Во-вторых, при установке оборудования для ИФА сроки исследований значительно сократятся, равно как и объемы проквашенной сыворотки.

В-третьих, как мы уже говорили, ИФА-лаборатория универсальна - это не только серологические исследования но и анализ кормов на токсины, бактериологические исследования, клиническая биохимия. Немаловажно использование компьютерных мощностей для обработки самой разноплановой информации, повышение производительности труда при использовании дозаторов и прочих лабораторных принадлежностей для рутинных исследований.