Изучение
возможностей создания системы скрининговой оценки
инфицированности поголовья птицы микроорганизмов рода Salmonella и вирусом болезни Марека
основанной на мультиплексной ПЦР
к.б.н.
Афонюшкин В.Н., к.в.н. Юшков Ю.Г., Городов В.С.
(lisocim@mail.ru,
www.laboratorium.narod.ru)
ГНУ ИЭВС и ДВ, г.Новосибирск
Совершенствование ПЦР технологий не ограничивается экстенсивным
увеличением количества ПЦР-тест-систем. Сегодня
ученые предлагают практике количественные варианты ПЦР анализа, FLASH-ПЦР, различные варианты
ПЦР предназначенные для изучения генетического полиморфизма изучаемых объектов
и т.д. Поэтому, на наш взгляд, традиционные ПЦР тесты можно рассматривать как уже
отживающие свое методики прошлого века. В то же время
наработанный материал, вполне рационально использовать как основу для более совершенных
ПЦР систем.
В связи с этим, специалистами нашего института ведется направление мультиплексных ПЦР. Технология учета ПЦР реакции основанная
на методе электрофореза и довольно высокая специфичность метода позволяют
проводить несколько реакций для индикации геномной
ДНК разных микроорганизмов одномоментно в одной
пробирке. Такой вариант постановки и называется мультиплексной ПЦР.
К преимуществам данного метода следует отнести снижение затрат на
реактивы для ПЦР и электрофореза, снижение трудозатрат на постановку реакции,
уменьшение загрузки оборудования и увеличение скорости постановки диагноза.
Таким образом, подобная технология оптимальна для массовых скрининговых исследований уровней инфицированности стад
птицы различными патогенами.
В данной работе мы сочли целесообразным разработать
мультиплексную ПЦР позволяющую одномоментно выявлять
геномную ДНК вируса болезни Марека (ВБМ) и
сальмонеллы SE в
патологическом материале. Другим важным элементом
обеспечивающим массовость исследований послужила разработка технологии
выделения ДНК из проб биоматериала позволяющая обрабатывать до 94 проб одномоментно.
Из пробы патологического материала используемого в исследованиях выделяли
ДНК с помощью технологи разработанной ранее (Городов В.С., Юшков Ю.Г., 2003).
Отработка режимов постановки ПЦР для индикации геноной ДНК ВБМ
Структура исследований заключалась в выявлении максимальной температуры отжига праймеров при которой сохранялся эффективный синтез ампликона
соответствующих размеров на ДНК различных генотипов ВБМ. Для этой цели
использовали ДНК выделенную из вакцинных штаммов 1-го,
2-го и 3-го серотипов. В качестве отрицательного контроля использовали ДНК
вируса инфекционного ларинготрахеита.
Для определения
инфицированности органов и тканей вирусом болезни Марека проводили ПЦР на
наличие гена А антигена, разработанную в нашей
лаборатории.
В реакции
использовали праймеры:
верхний: 5`-ATCGCGATGGAAGTTTTTGGT-3`
нижний: 5`-ATGCGGCTGAGGAGATTTC-3`
Сайты отжига праймеров 1210-1231п.н. и 1567-1549п.н. от первого
ТАТА-сигнала гена гликопротеина А вируса болезни
Марека. Размер ампликона 358 п.н.
Для реакции
использовали реакционную смесь с ксиленцианолом фирмы
«Амплисенс».
Всего проверили следующие температуры отжига: 46, 48, 50, 52, 55, 58, 60,
62, 63, 64, 65 оС. В диапазоне температур
46-55 оС
отмечались неспецифические реакции и обилие лишних полос на электрофореграмме.
Температура 65 оС являлась критической для отжига праймеров. Достаточно интенсивный синтез ампликона наблюдался при температуре 63 оС и
ниже (см. рис. 1).
Рис. 1 ПЦР проб печени отобранных
от птицы
из птицефабрики неблагополучной по
болезни Марека.
Примечание: 1,13 трек маркер мол. массы (730,700,410,310,170 пн),
трек 2 - положительный контроль,
трек 11 отрицательный контроль
остальные треки - пробы пат.материала
Разработка лабораторной модели мультиплексной ПЦР ВБМ-САЛ-КОМ
В процессе исследований использовали ПЦР тест-систему САЛ-КОМ для
выявления ДНК микроорганизмов рода сальмонелла фирмы «Амплисенс».
Выбор был обусловлен сходностью температур отжига праймеров с разработанной нами ПЦР на ДНК ВБМ
Реакцию
амплификации проводили по программе (см. табл.1)
Табл.1 Программа амплификации ПЦР на ген А антигена ВБМ
|
этап |
температура С |
число циклов |
время, мин |
|
1 |
95 |
1 |
пауза |
|
2 |
95 |
1 |
5 |
|
3 |
95 |
40 |
1 |
|
63 |
40 |
1 |
|
|
72 |
40 |
1 |
|
|
4 |
72 |
1 |
5 |
Цель эксперимента заключалась в изучении возможностей неспецифической
реакции 2-х ПЦР систем при их параллельной работе.
Для этого в
первую пробу добавили только праймеры к сальмонелле и
ДНК ВБМ, реакция была отрцательна, во вторую, четвертую
и пятую пробирки добавили смесь праймеров от обеих
ПЦР систем. Во вторую пробирку также добавили только ДНК ВБМ
выделенную из вакцины Бимарек – ситезировался
ампликон размерами 358 п.н., в четвертую пробирку
добавили смесь ДНК ВБМ и сальмонеллы в итоге в четвертой пробирке
синтезировалось 2 полоски на 358 и 225п.н.
в пятую пробирку добавили только ДНК микроорганизмов рода сальмонелла,
поэтому полоска была одна размерами на 225п.н., в третьей пробирке были праймеры на ВБМ и ДНК сальмонеллы - реакция отсутствовала
(см. рис. 2)
Рис.2 электрофореграмма №2 трек 1-
отрицательный контроль, трек 2 – ВБМ, трек 3 ДНК сальмонеллы, трек 4 ДНК ВБМ+сальмонелла, трек 5 – сальмонелла
Изучение специфичности мультиплексной ПЦР ВБМ+САЛ-КОМ
Для этой цели провели тестирование
ПЦР системы на наличие неспецифических реакций с нуклеиновыми кислотами
различных микроорганизмов (см. табл. 2).
Таблица 2. Изучение специфичности ПЦР ВБМ+САЛ-КОМ
|
№ трека |
Вид микроорганизма |
Наличие ампликона специфичного для ВБМ |
Наличие ампликона специфичного для САЛ-КОМ |
|
1 |
Pseudomonas
auregenosa |
- |
- |
|
2 |
S. aureus |
- |
- |
|
3 |
Serratia
marcescens |
- |
- |
|
4 |
E. coli
ATCC 25922 |
- |
- |
|
5 |
Пат.материал
от цыпленка положительного на сальмонеллу в ПЦР |
- |
+ |
|
6 |
Listeria
monocitogenes |
- |
- |
|
7 |
Iersinia
pseudotuberculosis |
- |
- |
|
8 |
Serratia
marcescens |
- |
- |
|
9 |
E. coli (полевой
изолят) |
- |
- |
|
10 |
Е. coli O157
H7 |
- |
- |
|
11 |
Пат.материал
от цыпленка отрицательный на сальмонеллу в ПЦР |
- |
- |
|
12 |
Пат.материал
от цыпленка положительный на сальмонеллу в ПЦР |
- |
+ |
|
13 |
Пат.материал
от цыпленка отрицательный на сальмонеллу в ПЦР |
- |
- |
|
14 |
ВБМ 2 и 3 серотипы |
+ |
- |
|
15 |
ВБМ + Salmonella |
+ |
+ |
|
16 |
Salmonella
(контрольная ДНК) |
- |
+ |
|
17 |
Отрицательный контроль |
- |
- |
Тестирование ПЦР ВБМ+САЛ-КОМ на птице из птицефабрик с различной эпизоотической
ситуацией
Для исследований были отобраны цыплята 8 - 10 дневного возраста из разных
птицефабрик и корпусов с различной эпизоотической ситуацией вообще и по болезни
Марека в частности (6 групп). Цыплята были подвергнуты диагностическому убою,
из проб печени выделена ДНК и подвернута тестированию на наличие геномов ВБМ и
микроорганизмов рода Salmonella
с использованием предложенной нами мультиплексной ПЦР «ВБМ+САЛ-КОМ».
Дополнительно тестировали наличие CELO-инфекции путем индикации генома аденовируса 1-го серотипа с
использованием разработанных нами праймеров
а также микоплазмы галлисептикум
с помощью набора МИК-ГАЛ фирмы «Амплисенс».
Таблица №3 Процент положительных ПЦР реакций
|
группа |
n |
Сальмонелла |
ВБМ |
Микоплазма |
CELO-инфекция |
|
1 |
10 |
80 |
100 |
80 |
40 |
|
2 |
10 |
100 |
100 |
70 |
20 |
|
3 |
10 |
100 |
100 |
0 |
|
|
4 |
10 |
100 |
60 |
30 |
|
|
5 |
10 |
60 |
100 |
0 |
|
|
6 |
10 |
50 |
50 |
20 |
0 |
Анализ таблицы №3 показывает различный процент
инфицированности цыплят ВБМ от 100 до 50%, между тем, все цыплята были привиты
вакциной «бимарек» производства ВНИИЗЖ и
теоретически, все группы должны были быть инфицированы вакцинным штаммом на
100%. Таким образом, мы можем считать целесообразным использование
разработанной нами ПЦР с целью оценки качества вакцинации и выявления причин
неполноценного инфицирования вакцинным штаммом.
Заключение: предложенная система скрининговой оценки инфицированности поголовья птицы
сальмонеллой и ВБМ состоящая из мультиплексной ПЦР и технологии по отбору,
хранению и выделению ДНК характеризуется достаточной специфичностью и воспроизводимостью.