Статья (3б-вариант)

                

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭНДОГЕННЫХ РЕТРОВИРУСОВ С ПОМОЩЬЮ ПЦР В ПОПУЛЯЦИИ МИНИ – СВИНЕЙ И ИХ ОСНОВАТЕЛЕЙ, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИМ СИСТЕМАМ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ КРОВИ.

  Айтназаров Р.Б., Юдин Н.С., Савина М.А., Ермолаев В.И., Ромащенко А.Г.

Институт цитологии и генетики Сибирское Отделение Российская Академия Наук, г. Новосибирск. Россия

630090 Новосибирск-90, пр. Лаврентьева 10, Тел.: (3832) 332819, Факс: (3832) 331278

E-mail: aitnazarov_r@mail.ru

 

Исследовано наличие эндогенных ретровирусов (PERV) в образцах крови пяти  пород свиней и двух подвидов дикого кабана,  которые предварительно были протипированы по ряду иммуногенетических систем белков сыворотки крови (аллотипам).  Полученные результаты показали, что   PERV всех трех типов  - А, В и С, содержатся в геномах практически всех особей мини-свиней и их родоначальных пород. Эти данные свидетельствуют, что  выведение непатогенных животных  затруднено. Требуются дальнейшие исследования, чтобы исключить риск инфекционных заболеваний, связанный с ксенотрансплантацией.  

        В последнее время нехватка доноров человеческих органов для пересадки привела к повышенному интересу к  ксенотрансплантации органов от животных. Развитие биотехнологии и медицины значительно расширило возможности использования внутренних органов и тканей сельскохозяйственных животных для нужд трансплантологии. Имеются сообщения что, настоящее время широко внедрены в медицинскую практику ксенотрансплонтация островков Лангерганса свиньи (Скалецкий Н.Н., Olack B. et al. 2000, Reinholt F.P. et al 1995), разработана и нашла применение пересадка нервных клеток свиньи больным хроническими, резистентными к традиционным способам лечения, заболеваниями центральной нервной системы (например, болезнь Паркинсона, хорея  Хантингтона, эпилепсия) ( Dinsmore J.H. et al. 2000), проводят перфузию крови пациентов через культивированные свиные гепатоциты (Первакова Э.И. 1995, Weiss R.A. 1999), для диализа используют свиные почки и селезенку (Weiss R.A. 1999). Свиньи специально селектированных для медико-биологических целей пород (мини-свиньи) являются наилучшими кандидатами среди представителей животного мира на поставку органов для пересадки человеку, так как их органы более всего сходны с человеческими по размеру и физиологическим параметрам. Созданное в Институте цитологии и генетики СО РАН   стадо первых отечественных миниатюрных свиней широко используется для многих медико-биологических исследований, в том числе совершенствуется ксенотрансплантация (Горелов, 2002, Айтназаров, 2003 ). Сибирские мини-свиньи являются гибридами вьетнамской вислобрюхой свиньи и геттингенских мини-свиней (гены карликовости),  дикого кабана (гены прочности и долголетия), домашних пород ландрас и крупной белой (гены белой масти и многоплодия) (Рисунок 1).

   Рисунок 1. Схема выведения сибирских лабораторных мини-свиней (Горелов И.Г.2001.).

 

     Эти мини-свиньи обладают крепкой конституцией, устойчивы к заболеваниям, неприхотливы к условиям содержания и кормления и соответствуют требованиям международного стандарта по основным параметрам для использования в медицине. (Тихонов, 1990).

    Одним из преимуществ ксенотрансплантации перед аллотрансплантацией (пересадка органов и тканей от другой особи того же биологического вида) является возможность более детального обследования донора, так многие инфекции передаются при гемотрансфузии и аллотрансплантации: вирусы иммунодефицита человека, гепатита В и С, герпеса, а также туберкулез; всего этого можно избежать при использовании ксеногенных тканей (Weiss R.A. 1999).

     Однако, ксенотрансплантация провоцирует риск передачи инфекций животных людям,  так же как и появление новых инфекций. Ксенотрансплантация органов от свиней человеку связана с потенциальной опасностью заражения реципиента  эндогенными ретровирусами (porcine endogenous retrovirus (PERVs)), которые являются составными частями геномов свиней. Вирусный геном исходно представляет собой РНК, которая при инфекции превращается в ДНК и, внедряясь в геном хозяйской клетки, становится провирусом (Рис. 2).

Рисунок 2. Схема жизненного цикла  ретровируса.

 

    Внедренный ретровирусный геном навсегда остается в составе генома клетки хозяина. Его судьба зависит от множества обстоятельств, которые в конечном счете определяют, будет ли он активен или его активность будет подавлена клеткой. Активный провирус синтезирует РНК, которая подвергается процессингу, направляет синтез вирусных белков, упаковывается в них и дает новый инфекционный вирус. Как правило, ретровирусы инфицируют соматические клетки. Но изредка может происходить инфекция клеток зародышевого пути, из которых развиваются половые клетки, и тогда внедренный провирус становится наследуемым и превращается в новый генетический элемент генома. Он становится эндогенным ретровирусом.

    Способность эндогенного ретровируса образовывать инфекционные вирусные частицы теряется вследствие мутаций. Но способность синтезировать РНК и белки, по крайней мере для некоторых из множества внедренных в геном эндогенных   ретровирусов, сохраняется в течение десятков миллионов лет эволюции. Более того, в течение длительного времени сохраняется также способность к ретропозиции, т.е. к обратной транскрипции провирусной РНК и внедрению синтезированной копии обратно в геном. При ретропозиции исходный провирус сохраняется на своем месте, вновь синтезированная копия внедряется в другое место. Если сохраняется способность к ретропозиции, число копий провируса в геноме возрастает, хотя новых инфекций не возникает. Эндогенные ретровирусы и родственные элементы существуют, по-видимому, у всех позвоночных, включая эндогенные ретровирусы свиней (PERV), и в большом количестве существуют эндогенные ретровирусы у человека – human endogenous retroviruses (HERV) (Leib-Mosch C. et al.1996., Patience C., 1997.). К этому можно добавить, что присутствие в геномах млекопитающих множества эндогенных ретровирусов ставит проблемы, которые не так очевидны, как содействие размножению ВИЧ, но не менее серьезны. Одна из них - проблема ксенотрансплантации, при которой органы животного пересаживают человеку. Вопрос в том, не окажутся ли эндогенные ретровирусы животного активными в человеческих клетках и не появится ли новый тип вируса за счет рекомбинаций эндогенных ретровирусов животного и человека (Sverdlov E.D.1998, Свердлов Е.Д. 1999). Находясь в латентной форме, ретровирусы, тем не менее, могут с некой вероятностью вызывать заболевания у человека, в том числе онкологические, если они активируются при пересадке органа от животного-донора (Шумаков, 1995). Эти данные вызывали серьезный спор о безопасности ксенотрансплантантов свиньи для человека. Вирус свиней, передающийся при межвидовой трансплантации, может являться причиной эпидемий, подобных эпидемии СПИДа.

     Геномная РНК ретровирусов  состоит из четырех основных генов: (5`---3`) gag, pro, pol, env, кодирующих соответственно внутренние вирионные белки, протеазу, обратную транскриптазу и гликопротеины наружной оболочки вирионов. Ген env весьма вариабелен, его продукты определяют круг хозяев и антигенные свойства вириона

(Рис. 3).

Рисунок 3. Схема генома простого ретровируса.

 

    Международным комитетом по таксономии вирусов согласно первичной последовательности гена env  ретровирусы PERV были классифицированы на 3 типа:  А, В и С (Орлянкин, 1996). Показано, что именно ретровирусы PERV типа C способны инфицировать клетки человеческой эмбриональной почки (HEK)293 и клетки линии HeLa in vitro (Patience, Takeuchi, 1997). Известно, что  геномы свиней, в зависимости от породы животного, содержат разные типы PERV (Jin et al., 2000).  Поэтому, для оценки потенциальной опасности внесения инфекционного агента в организм реципиента при пересадке органов от миниатюрных свиней необходимо предварительно определить присутствие PERV в геноме  животного – донора.

      Целью данной работы являлось выявление ретровирусов PERV разных типов (А, В и С) в геномах лабораторных мини-свиней  Экспериментального хозяйства Института цитологии и генетики СО РАН  и их некоторых родоначальных пород, в том числе диких кабанов, которых использовали при формировании стада. Все изученные животные охарактеризованы по иммуногенетическим системам белков сыворотки крови – аллотипам.

       Материалы и методы: Образцы. Исследования проводили на образцах ДНК, полученных из крови свиней: лабораторных мини-свиней Экспериментального хозяйства Института цитологии и генетики СО РАН (n = 160), крупная белая порода свиней представлена 2 популяциями: ЗАО АПК «Иня» с. Сарапулка Мошковского  р-на Новосибирской обл. (n = 99)  и Ачинской популяции (n=101); ландрас – 2 популяциями: Экспериментальное хозяйство    ИЦиГ  СО РАН (n = 30)  и  Кудрешовский племферма (n = 15);  породы СМ-1 стадо учхоза НГАУ «Тулинское» создаваемого сибирского типа новой скороспелой мясной породы (n = 21);  Дюрок Кудрешовский племферма (n = 10); среднеазиатский  кабан (Sus scrofa nigripes) обитающий в Чуйской долине  в Киргизии (n = 4);  европейский кабан (Sus scrofa scrofa L.) г. Мелитополь Украина (n = 31).  

     Аллотипы сывороточных белков исследуемых животных определяли стандартными методами, описанными литературе (Баранов О.К. 1981, Князев С.П. и др. 1982, Беляев Д.К. и др. 1974). Для аллотипирования свиней использовался тест двойной иммунодиффузии в 1.2%-ном геле агара «Дифко» по Ухтерлони  в микромодификации на предметных стеклах. Иммуноэлектрофоретический анализ проводили в высоковольтной микромодификации, предложенной П. Грабаром; для приготовления агарового геля использовали 0.025М веронал-мединаловый буфер (рН = 8.6). Гистохимическое изучение выявляемых антигенов проводили путем специфического окрашивания преципитатов (комплексов «антиген-антитело») на стеклах с высушенными после диффузии пластинками геля суданом черным и амидо черным.

 Выделение ДНК из крови. Выделение ДНК из образцов крови осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции по модифицированной методике Смита с соавт. (Смит и др., 1990). К образцу крови (~ 10 мл) добавляли 5-6 объемов буфера А (10мМ трис-HCl, pH=7.5; 10 мМ NaCl; 3мМ MgCl₂) и гомогенизировали, растирая сгустки в гомогенизаторе Поттера. Осадки, полученные центрифугированием при 2500g, промывали дважды буфером А и ресуспензировали в 0.5 мл буфера В (10мМ ЭДТА; 100 мМ NaCl; 50мМ трис-HCl, pH=8.5). После добавления SDS до 0.5% и протеиназы К до 200 мкг/мл смесь инкубировали 2 часа при 65⁰С, или в течение ночи при 37⁰С. Депротеинизацию проводили последовательно водонасыщенным фенолом, смесью фенол - хлороформ (1:1) и, наконец, хлороформом. ДНК осаждали добавлением раствора ацетата аммония (NH₄Ac) до 2.5М и 2.5 объема этанола. Осадок, полученный центрифугированием на микроцентрифуге “Eppendorf” в течение 10 минут, промывали 70% этанолом и растворяли в воде до концентрации ДНК 0.5 мкг/мкл. Дополнительную очистку некоторых образцов ДНК проводили переосаждением ПЭГ (полиэтиленгликоль). Для повторного переосаждения добавляли 1 V  20% полиэтиленгликоля 6000 с 2,5 М NaCl и инкубировали 30 мин. при 37°С. Осадок, полученный центрифугированием 12000g  15 мин, двукратно промывался 75% этанолом. Концентрацию нуклеиновых кислот в анализируемых образцах ДНК определяли спектрофотометрически при длине волны 260 нм.

 Праймеры. Праймеры, специфичные для последовательности гена env свиных эндогенных ретровирусов (PERV) разных типов, были взяты на основании литературных источников.

Таблица 1.  Типо – специфичные  праймеры эндогенных ретровирусов свиней.

 

 

Праймеры	Последовательность   ( 5’--- 3’)	Авторы
env     прямой env     обратный	GCT ACC TCT TCT TGT TGG CTA TGC  CAC CAC CTG TCA TAA  CCA GGT ACC	Akiyoshi et al., 1998
PL 170 (envA  прямой). PL 171 (envА обратный).	TGG AAA GAT TGG CAA CAG CG     AGT GAT GTT AGG CTC AGT GG	Le Tissier P. et al, 1997
PL 172 ( envB прямой )   PL 173 (envB обратный)	TTC TCC TTT GTC AAT TCC GG    TAC TTT ATC GGG TCC CAC TG	Le Tissier P. et al, 1997
PL 205 (envC прямой).   PL 206(env C обратный).	CTG ACC TGG ATT AGA ACT GG   ATG TTA GAG GAT GGT CCT GG	Takeuchi Y. et al, 1998

 

ПЦР. Генотипирование проводилось типо – специфичными  праймерами для эндогенных ретровирусов свиней методом ПЦР (Akiyoshi et al. 1998; Takeuchi et al., 1998; Le Tissier et al., 1997). К каждому типу PERV  подбирались отдельные услови. Для анализа гена  env ПЦР  проводили в режиме:  денатурация 3 мин при 95°C; затем 33 циклов  денатурация 1 мин при 95°C, отжиг 1 мин при 61°C; синтез 1 мин при 72°C; Для других типов PERV (A,B и С) амплификацию проводили по следующей схеме: предварительное нагревание при 95°C – 3 мин, далее 34 циклов: денатурация 45 сек при 95°C, отжиг 45 сек при 63°C; синтез 45 сек при 72°C. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 0,5 мкг тотальной ДHК, по 1  мкМ праймеров, по 0,2мМ каждого из dNTP,  ПЦР-буфер (75мМ Трис-HCl (pH 9,0), 3 мМ MgCl₂, 20 мМ (NH₄)₂SO₄, 0,01% твин-20) и 1,25 ед. Taq-полимеразы. Продукты амплификации оценивали электрофорезом в 4% ПААГ,  окрашивание проводили бромистым этидием, длину фрагмента определяли ДНК маркерами («СибЭнзим» Новосибирск).

  Результаты и обсуждение  Результаты амплификации с разными парами праймеров, представлены на Рис. 4. Для проведения ПЦР–анализа были, использованы все четыре пары праймеров (см. Табл.1), одна из которых является родоспецифичной и при амплификации дает продукт длиной 266 п.н.; остальные пары праймеров являются типо-специфичными и при амплификации дают продукты соответствующей длины: тип-специфического фрагмента гена env ретровируса типа А размером 360 п.н., тип-специфического фрагмента гена env ретровируса типа В размером 264 п.н. и тип-специфического фрагмента гена env С размером 281 п.н., наличие которых оценивали электрофорезом 4% ПААГ с окрашиваним бромистым этидием. Условия амплификации фрагментов ретровирусов были взяты из оригинальных работ с незначительными модификациями. Как видно из электрофореграммы, все использованные праймеры позволяли синтезировать специфичный фрагмент.

      Данные о наличии ретровируса гена env типа А, В и C в образцах ДНК мини-свиней, свиней родоначальных пород и кабанов разных подвидов приведены в Таблице 2. У мини-свиней практически все особи  обладают  ретровирусами всех трех типов гена. Гены env, env-A, env-B были найдены у всех особей породы СМ-1, а ген env C у 76,2%.   Большая часть свиней крупной белой породы имела гены типа env А (92,5%), env В (91.5%), но не содержали  env C (60,4%). У 30 изученных особей свиней породы ландрас гены типа env А и env В выявлены у 96,7%, а гены env С у 83,3%. Животные диких популяций отличались от домашних по содержанию вирусных частиц (PERV) в их геноме. Существенно меньше (25%) выявлено ретровируса гена env B у среднеазиатского подвида кабана, гена env C  (25%)  у европейского подвида кабана. У  среднеазиатского подвида, однако, ретровирус типа env C  обнаружен у 75% животных (Таблица 2).

 

 

                                          М    C   B    A  env  М   C   B   A  env  М                    .                                                                        

                                                                                                                                                         

                                                                                                                      700                                                                                  

                                                                                                                      600                                                                                   

                                                                                                                      500                                                                                    

                                                                                                                      400                                                                                     

                                                                                                                      300                                                                                    

                                                                                                                                                              

                                                                                                                      200                                                                                     

                                                                                                                                                              

                                                                                                                      100                                                                                     

                                                                                                                                                              

                                                                                                                                                            

 

 

 

Рис. 4. . Электрофореграммы амплифицированных фрагментов ДНК env, env-A, env-B  и env-C  эндогенных ретровирусов свиней в 4% полиакриламидном геле, М-ДНК маркер, длина в п.н. показана справа.

 

 Таблица 2.

Породы свиней	Общее колич.,      n	ген   PERV
		еnv		env A		env B		env C
		+   (%)	- (%)	+  (%)	-   (%)	+   (%)	-   (%)	+      (%)	- (%)
Мини-свиньи	160 = n	99,4%	0,6%	98,8%	1,2%	98,1%	1,9%	98,8%	1,2%
Крупно-белые  св. «Ачинск»	101 = n	100%	0%	92,1%	7,9%	99%	1%	39,6%	60,4%
Крупно-белые св.с\х «Иня».	99  = n	83,8%	16,2%	92,9%	7,1%	83,8%	16,2%	17,2%	82,8%
Ландрас. (эксп. хоз. Кайинка.)	30  = n	100%	0%	96,7%	3,3%	96,7%	3,3%	83,3%	16,7%
Ландрас. Кудрешев.пл.ф	15 = n	40%	60%	86,7%	13,3%	66,7%	33,3%	20%	80%
СM – 1(НГАУ)	21 = n	100%	0%	100%	0%	100%	0%	76,2%	23,8%
Дюрок. Кудрешев.пл.ф	10  = n	30%	70%	80%	20%	40%	60%	20%	80%
Кабан среднеазиатского подвида	4   = n	100%	0%	50%	50%	25%	75%	75%	25%
Кабан европейского  подвида	31  = n	22,5%	77,4%	74,2%	25,8%	67,7%	32,3%	12,9%	87,1%

 

 

 

 

 

      Полученные нами данные о значительном обогащении геномов мини-свиней и их родоначальных пород эндогенными ретровирусами хорошо согласуются с данными других авторов, полученными для пород крупно белой и средне белой свиньи (Jin et al., 2000). Таким образом, в результате работы создана коллекция образцов ДНК мини – свиней, которая представляет самостоятельную ценность для дальнейших молекулярно-генетических исследований. С использованием методики генотипирования типов ретровирусов на основе ПЦР показано, что эндогенные ретровирусы PERV всех трех типов  - А, В и С содержатся в геномах практически всех особей мини-свиней и основателей их пород. Можно констатировать, что существует опасность активации эндогенных ретровирусов свиней при пересадке ксенотрансплантантов человеку, поэтому при селекции животных следует учитывать данный факт.

 

                                                       ЛИТЕРАТУРА

 

1. Тихонов В.Н., Генетика  мини- свиней. – Новосибирск: ИциГ СО АН СССР, 1990.
2. Горелов И.Г., Савина М.А., Вареник Р.Н., Ермолаев В.И. Сибирские миниатюрные свиньи – новая биомодель для медико-биологических исследований // Сиб. Вестн. с.-х. науки. -  2001, № 3-4, с. 81-87

3.      Горелов И.Г., Савина М.А., Новиков А.А., Юдина О.П., Ермолаев В.И. Свиньи как     модоль для медико-биологических исследований // Аграрная Россия (научно-производственный журнал). 2002. № 5. С. 45-49

4. Айтназаров Р.Б. Проблемы использования внутренних органов сельскохозяйственных  животных // Био (журнал для специалистов птицеводческих  

            и животноводческих хозяйств), Екатеринбург, 2003. № 12(39). С. 2-4

5.  Орлянкин Б. Г. Классификация и номенклатура РНК – содержащих вирусов позвоночных // С.- х. Биол.1996. №2. С. 3-24.
6. Трансплантология. Руководства. Под ред. В.И.Шумаков. М., 1995. С. 17-20.
7. Смит К., Клко С., Кантор Ч. Пульс-электрофорез и методы работы с большими молекулами ДНК // В сб. Анализ генома. Под ред. К. Дейвиса. М.: Мир, 1990. С. 58-94.

8.   Свердлов Е.Д. Ретровирусные регуляторы экспрессии генов в геноме человека как возможные факторы его эволюции.// Биоорганическая химия.1999.№11.с.821-827

9.    Скалецкий Н.Н. Культуры островковых клеток поджелудочной железы и их     трансплантация в эксперименте и клинике // Автореф. …  д-ра мед. наук.- М., 1999.- 69 с.

10.   Первакова Э.И. Коррекция восстановительных процессов в пораженной печени при использовании систем биоикусственной поддержки. // Автореф. … канд. мед. наук.- М., 1998.- 33 с

11.  Баранов О.К. Эволюционная иммуногенетика сывороточных белков животных. Новосибирск: Наука, 1981.С. 224.

12.  Князев С.П., Тихонов В.Н. Приготовление антисывороток – реагентов и иммуногенетическое изучение аллотипов крови домашних и диких свиней //Изв. СО АН СССР. Сер. биол. наук. 1982. Вып. 2. С. 150-155.

13.  Беляев Д.К., Баранов О.К., Савина М.А. и др. Идентификация пяти аллотипов сывороточных а₂-липопротеинов – эстераз американской норки (Mustela vison) // Генетика. 1974.Т.10.№1.С.62-70.

14. Jin H., Inoshima Y., Morooka A., Wu D., Sentsui H. Expression of porcine endogenous retrovirus in peripheral blood leukocytes from ten different breeds // Transplant Infectious Disease. 2000. V. 2.P. 11-14

15. Akiyoshi  D. E., Denaro M.,Zhu H., Greenstein J.L., Banerjee P., Foshman J.A. Identification of a full-length cDNA for an endogenous retrovirus of miniature swine // J Virol.1998.V.72.P. 4503-4507.
16. Le Tissier P., Stoye J. P., Takeuchi Y., Patience C., Weiss R. Two sets of human – tropic pig retroviruses // Nature.1997. V. 389.P. 681-682.
17. Takeuchi Y., Patience C., Magre S., Weiss R. A., Banerjee P.T., Le Tissier P., et al. Host range and interference studies of three classes of pig endogenous retrovirus // J Virol. 1998. V. 72. P.9986-9991.
18.  Weiss R.A. Xenografts and Retroviruses. // Science.- 1999.- Vol. 285.- P.1221-1222.

19.  Olack B., Manna P., Jaramillo A. et al. Indirect recognition of porcine swine leucosyte Ag class I molecules expressed on islets bu human CD4+ T lymphocytes. // J. Immunol.- 2000.- №165(3).- Р.1294-1299.

20.   Reinholt F.P., Hultenby K., Tibell A. et al. Survival of fetal porcine pancreatic islet tissue transplanted to a diabetic patient: findings by ultrastructural immunocytochemistry.// Xenotransplantation.- 1998.- №5(3).- Р.222-225

21.  Leib-Mosch C., Seifarth W. // Virus Genes. 1996.V.11.P. 133-145.

22.  Patience C., Wilkinson D.A., Weiss R.A.// Trends in Genet. 1997. V.13.P.116 –120.

23.  Sverdlov E.D.//FEBS Lett. 1998. V. 428. P. 1-6.

24.   Dinsmore J.H., Manhart C., Raineri R. No evidence for infection of human cells with porcine endogenous retrovirus (PERV) after exposure to porcine fetal neuronal cells. // Transplantation.- 2000.- №70(9).- Р.1382-1389.