УДК: 636.4:579.252.58+579.842.11

АССОЦИАЦИИ ЭНДОГЕННЫХ РЕТРОВИРУСОВ РАЗНЫХ ТИПОВ С ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МАРКЕРАМИ В ПОПУЛЯЦИЯХ ДОМАШНИХ И ДИКИХ СВИНЕЙ

Р.Б. Айтназаров¹, В.И. Ермолаев¹, С.В. Никитин¹, М.А. Савина¹, В.Ф. Кобзев¹, С.П. Князев², Г.М. Гончаренко³, В. А. Бекенёв³, Н.С. Юдин¹

В результате исследования ДНК свиней пород ландрас, крупная белая (новосибирского и ачинского типов) и диких кабанов кавказского подвида Sus scrofa attila, установлены специфичные для этих популяций положительные и отрицательные ассоциации эндогенного ретровируса типа A c Y-хромосомой и локусами EAE, EAK, LPB, а также эндогенного ретровируса типа В с локусами aM, EAE, LPB.

 

Анализ последовательности ДНК (секвенирование) полного генома свиньи, активно осуществляемый в настоящее время, несомненно, будет способствовать решению множества проблем, связанных с генетикой хозяйственно-важных признаков этого вида животных. На первых этапах  молекулярно-генетических исследований важно построение точной генетической карты, обобщающей данные о структуре и функциях протяженных локусов генома. Секвенирование геномов человека, мыши и других видов показало, что значительную часть геномов млекопитающих занимают повторяющиеся последовательности ДНК (короткие и длинные рассеянные повторы, эндогенные ретровирусы и др.). Присутствие в геноме животного эндогенных ретровирусов, потенциально способных влиять на экспрессию некоторых генов, обуславливает необходимость тщательного исследования их локализации на хромосомах. В ДНК свиньи также обнаружены эндогенные ретровирусы (Porcine Endogenous RetroVirus, PERV) А, В и С типов, которые различаются по последовательности нуклеотидов гена env и своим биологическим свойствам [1]. В последнее время, появились работы по физическому картированию PERV путем флуоресцентной гибридизации in situ [2, 10]. Однако разрешающая способность этого метода невелика, поскольку стандартная идиограмма RGB-окрашивания хромосом свиньи содержит около 300 бэндов. Анализ ассоциаций является гораздо более чувствительным методом, поскольку позволяет выявить генетическое сцепление при расстоянии между маркерами на генетической карте менее 1 сМ, что составляет на физической карте около миллиона пар нуклеотидов [4]. Однако нам не известны публикации по выявлению ассоциаций PERV с традиционными генетическими маркерами свиньи.

Целью данного исследования являлось выявление ассоциации эндогенных ретровирусов PERV типов А, В и С с рядом генетических маркеров, ранее уже картированных на хромосомах свиньи.

Методика. Материалом для исследования послужили образцы крови от 261 домашних и диких свиней. Домашние свиньи представлены породами ландрас - 30 голов из Экспериментального хозяйства СО РАН и крупная белая – 200 голов из ЗАО АПК "Иня". Последние представляют два внутрипородных типа: новосибирский и ачинский, соответственно 99 и 101 особь. Образцы крови диких кабанов кавказского подвида (Sus scrofa attila) получены от 31 животного из Северного Причерноморья.

Типирование образцов крови проводили стандартными методами, принятыми для изучения эндогенных ретровирусов свиней (PERV) [3], аллотипов сыворотки крови [5] и эритроцитарных антигенов групп крови [6]. В качестве генетических маркеров свиней использовали 9 аллотипов четырёх генетических систем: a-макроглобулины (aM), иммуноглобулины (IgG), липопротеины высокой плотности (Lpr), липопротеины низкой плотности (Lpb) и 11 аллелей пяти систем эритроцитарных антигенов свиней: EAD, EAE, EAG, EAL и EAK. В анализе также учитывали пол животных.

Наличие и силу ассоциации различных типов ретровирусов с генетическими маркерами определяли с помощью коэффициента ассоциации r_A [7] по формуле , где a – число носителей ретровируса, позитивных по маркеру, b – число не-носителей, позитивных по маркеру, c – число носителей, негативных по маркеру, d – число не-носителей ретровируса, негативных по маркеру. Достоверность коэффициента ассоциации оценивали критерием c² по формуле , где N – объём выборки. Направление связи определяли на основании знака коэффициента ассоциации: r_A>0 – ретровирус и маркер находятся в "фазе притяжения", r_A<0 – соответственно, в "фазе отталкивания". Достоверность существования ассоциации ретровируса и маркерного локуса в целом оценивали суммарным критерием c² по формуле , где  – значения частных критериев, полученных для отдельных выборок и (или) отдельных маркеров исследуемого локуса.

Результаты и обсуждение. Коэффициент ассоциации «тип ретровируса – маркер» вычисляли для 111 пар, включающих маркеры аллотипов сыворотки крови у животных четырех исследованных популяций (табл. 1), и для 33 пар, включающих маркеры систем групп крови у животных крупной белой породы новосибирского типа (табл. 2) – всего для 144 пар. При этом для 39 пар r_A не был определен ввиду отсутствия в популяциях полиморфизма по маркеру. Таким образом, была проведена оценка коэффициента ассоциации в общей сложности для 105 пар - «тип ретровируса – маркер», среди которых 14 значений коэффициентов оказались статистически достоверными. Поскольку первый порог достоверности результатов предполагает 5%-ную вероятность случайного получения статистически значимых оценок, в нашем исследовании ожидаемое число достоверно ассоциированных пар в результате случайной ошибки должно составить 105´0,05=5,25; что статистически значимо меньше (c² = 15,35; P < 0,001) фактического их числа, т.е. 14 пар. Таким образом, около 9 пар обнаруженных достоверных ассоциаций ретровирусов PERV с генетическими маркерами свиней можно рассматривать как реально существующие.

Для того чтобы выделить ассоциации, существование которых наиболее вероятно, дополнительно была проведена оценка ассоциаций отдельных типов ретровирусов PERV с изученными полиаллельными локусами в целом и (или) при объединении выборок из популяций с помощью суммарного критерия c² (табл. 3). Число генетических локусов, статистически значимо ассоциированных с тем или иным типом PERV, оказалось равным 6, а число выявленных для этих локусов достоверных ассоциаций специфических маркеров в отдельных популяциях животных равно 8. Это хорошо совпадает с ранее вычисленным предполагаемым их числом (около 9 пар, см. выше). Таким образом, есть основания полагать, что 6 из 10 исследованных маркеров действительно могут быть физически сцеплены с ретровирусами (табл. 3).

Наиболее интересными нам представляются следующие ассоциации.

Положительная ассоциация локуса LPB одновременно с типами A и B эндогенных ретровирусов PERV (табл. 3). Данную ассоциацию можно объяснить двумя причинами - либо сайты инсерции обоих ретровирусов находятся на одной хромосоме рядом с локусом LPB, либо вблизи этого локуса встроен рекомбинантный вариант ретровируса [2], содержащий в составе амплифицируемого фрагмента ДНК последовательность нуклеотидов, гомологичную обоим типам вирусов.

Ассоциации локусов двух систем групп крови EAE и EAK, локализованных на хромосоме 9, с PERV A (табл. 3). В этом случае с большой вероятностью можно говорить о двух различных сцепленных локусах, поскольку расстояние между локусами EAE и EAK, очень далеко отстоящими друг от друга на генетической карте, составляет не менее 140 сМ [8]. Следует заметить, что коэффициенты ассоциации, выявленные для каждого из аллелей локуса системы EAE и эндогенного ретровируса типа A, имеют противоположные знаки. Следовательно, в соответствии со знаком r_A, ретровирусы могут находиться на гомологичных хромосомах либо в цис-, либо в транс-положении по отношению к исследуемым аллелям системы EAE. Так как PERV A положительно ассоциирован с аллелями EAE^edg и EAE^edf, последний из которых является мутацией первого, возникшей уже у домашней формы Sus scrofa [9], можно предполагать, что аллель EAE^edf возник уже после формирования группы сцепления PERV A – EAE.

Кроме перечисленных выше ассоциаций, по-видимому, имеет место также ассоциация локуса aM с PERV B. Из-за отрицательного значения коэффициента ассоциации можно полагать, что этот тип ретровируса находится в "фазе отталкивания" с аллелями aM^,1,2,3 и aM^,2,3,кодирующими аллотипы a-макроглобулина (aM1, aM2 и aM3) (табл. 1). Вероятно, копия PERV A локализована на X-хромосоме. Это предположение следует из отрицательного значения коэффициента ассоциации (r_A= -0,28; табл. 1), вычисленном для особей мужского фенотипа (с Y-хромосомой). Наблюдаемую ассоциацию локуса EAG, локализованного на хромосоме 15, с ретровирусом PERV С, мы рассматриваем пока как артефакт. В данный момент трудно объяснить следующее противоречие: в диаллельной системе EAG достоверная отрицательная ассоциация аллеля EAG^b с PERV С (r_A= -0,32; табл. 2) предполагает такую же, но положительную ассоциацию этого ретровируса с альтернативным аллелем EAG^a. В нашем исследовании этого не наблюдается (табл. 2), поэтому мы вынуждены считать обнаруженный феномен артефактом до детального выяснения причин данного явления.

Недавно опубликованные цитогенетические исследования мини-свиней Westran [2], свидетельствуют о наличии ретровирусов PERV A на 9-ой и Х- хромосомах, а также ретровирусов PERV B на 5-ой и 9-ой хромосомах. Эти результаты согласуются с представленными в настоящей работе данными об ассоциациях тех же типов ретровирусов с генетическими маркерами, локализованными также на хромосомах 5, 9 и Х. Однако следует отметить, что в литературе имеются сведения об отсутствии эндогенных ретровирусов типов А и В у свиньи крупной белой породы на этих хромосомах [10]. Для окончательного выяснения вопроса о местах локализации ретровирусов на хромосомах этой породы свиньи необходимо проанализировать большее число особей из разных популяций, поскольку картина распределения ретровирусов на хромосомах зависит не только от породной принадлежности, но и от индивидуальных особенностей животных [2]. Вместе с тем, нельзя исключить, что часть наблюдаемых ассоциаций вызвана не физическим сцеплением на одной хромосоме исследованного нами  маркера и ретровируса, а взаимодействием нескольких аллелей, локализованных на различных хромосомах, один из которых физически сцеплен с ретровирусом.  Поскольку при отборе наиболее адаптивных и селективно ценных особей нарушается случайность сочетаний независимых генетических маркеров в популяции, это может привести к возникновению устойчивых ассоциаций между ними.

Таким образом, в результате исследования домашних свиней пород крупная белая (новосибирского и ачинского типов), ландрас и диких кабанов, установлены ассоциации ретровируса PERV A c локусами эритроцитарных антигенов EAE, EAK, LPB и полом животных, а также ретровируса PERV В с локусами aM, EAE и LPB. Причем у разных типов и пород свиней эти ассоциации могут присутствовать или отсутствовать. Полагаем, что эти ассоциации могут детерминировать иммунный статус, жизнеспособность животных и оказывать влияние на их рост, развитие и продуктивность.

Работа была частично поддержана грантом РФФИ № 03-04-48569 и грантом РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека».

                                                 Литература.

1. Айтназаров Р.Б.//Био.-2003.-N12(39).
2. Lee J.H., Webb G.C., Allen R.D.M. et al.//Journal of Virology.-2002.-V.76.-N11.
3. Jin H., Inoshima Y., Wu D. et al.//Transplant Infectious Disease.-2000.-V.2.-N1.
4. Hoh J., Ott J.//Nature Reviews Genetics.-2003.-V.4.-N9.
5. Митичашвили Р.С., Мирцхулава Э.Г., Кочлашвили Т.И. и др.//Известия СО АН СССР. Серия биол. наук.-1989.-Вып. 3.
6. Andresen E.//Annals of the New York Academy of Sciences.-1962.-V.97.
7. Лакин Г.Ф. Биометрия.-М.: Высшая школа, 1990.
8. The Genetics of the Pig //Eds. M. Rotshild and A. Ruvinsky.-CAB INTERNATIONAL, New York, 1998.
9. Nikitin S.V., Knyazev S.P., Orlova G.V.// In: Biodiversity and Dynamics of Ecosystems in North Eurasia. Vol. 5. Part 3: Biodiversity and Dynamics of ecosystems of North-Eastern Asia. Russian Academy of Sciences. Siberian Branch. August 21-26, IC&G, Novosibirsk, 2000.
10. Rogel-Gaillard C., Bourgeaux N., Billault A. et al.//Cytogenet Cell Genet.-1999.-V.85.-N.3-4.

¹Институт цитологии и генетики СО РАН,

630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10

²Новосибирский государственный аграрный университет,

630039, Новосибирск,  ул. Добролюбова, 160

³Cибирский научно-исследовательский и проектно-технологический институт животноводства СО РАСХН,

630501, г. Краснообск Новосибирской области

ASSOCIATIONS OF PORCINE ENDOGENOUS RETROVIRUSES OF VARIOUS TYPES WITH GENETIC MARKERS OF DOMESTIC AND WILD PIG POPULATIONS

R.B. Aitnazarov, V.I. Ermolaev, S.V. Nikitin, M.A. Savina, V.F. Kobzev, S.P. Knyazev, G.M. Goncharenko, V.A. Bekenyov, N.S. Yudin

Associations between porcine endogenous retroviruses (PERV) A, B and C type DNA and some genetic markers are investigated in Large White (Novosibirsk and Achinsk types), Landras pig breeds and wild boars (Sus scrofa attila). Strong population-specific positive and negative associations between PERV A, EAE, EAK, LPB loci and Y chromosome, between PERV B and aM, EAE, LPB loci have been found.

Таблица 1. Значения коэффициента ассоциации (r_A) различных типов эндогенных ретровирусов с аллотипами сыворотки крови и полом животных в популяциях домашних и диких свиней.

 

Примечание: «н.о.» - коэффициент r_A не определен ввиду отсутствия полиморфизма по маркеру; « - » - нет данных; ^* p<0,05; ^** p<0,01; ^*** p<0,001.

Таблица 2. Значения коэффициента ассоциации (r_A) различных типов эндогенных ретровирусов с аллелями систем эритроцитарных антигенов у свиней новосибирского типа крупной белой породы.

 

Примечание: ^* p<0,05; ^** p<0,01; ^*** p<0,001.

Таблица 3. Оценка достоверности ассоциаций аутосомных генетических маркеров и пола с эндогенными ретровирусами разных типов.

Генетический маркер	Название локуса	Локализация на хромосоме1	Тип ретро-вируса	Суммарный  (d.f.)
α-макроглобулин2, aM	PLP1	5	A	2.60 (6)
			B	16.26* (6)
			C	9.41 (6)
иммуноглобулин класса G2, IgG	IGHG	7	A	5.02 (9)
			B	12.45 (9)
			C	8.65 (9)
липопротеин низкой плотности2, Lpb	LPB	?	A	15.65** (5)
			B	13.03* (5)
			C	8.20 (5)
липопротеин высокой плотности3, Lpr	LPR	9	A	2.88 (2)
			B	0.87 (2)
			C	2.12 (2)
Пол3	-	Y	A	6.14* (2)
			B	0.87 (2)
			C	2.67 (2)
эритроцитарные антигены D	EAD	12	A	1.06 (1)
			B	3.41 (1)
			C	1.37 (1)
эритроцитарные антигены E4	EAE	9	A	33.97*** (4)
			B	9.80* (4)
			C	4.17 (4)
эритроцитарные антигены G4	EAG	15	A	2.53 (2)
			B	4.09 (2)
			C	11.77** (2)
эритроцитарные антигены L4	EAL	4	A	4.09 (3)
			B	7.19 (3)
			C	2.42 (3)
эритроцитарные антигены K	EAK	9	A	4.26* (1)
			B	0.50 (1)
			C	0.37 (1)

 

Примечание: ¹Сведения взяты из работы [8]; ²суммирование по выборкам и по всем маркерам локуса; ³суммирование по выборкам; ⁴суммирование по всем маркерам локуса; ^*p<0,05; ^** p<0,01; ^*** p<0,001.

Перечень авторов:

1)      Айтназаров Руслан Бейшеналиевич

Институт цитологии и генетики СО РАН,

630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10

 

2)      Ермолаев Виктор Иванович

Институт цитологии и генетики СО РАН,

630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10

 

3)      Никитин Сергей Вячеславович

Институт цитологии и генетики СО РАН,

630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10

 

4)      Савина Марина Анатольевна

Институт цитологии и генетики СО РАН,

630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10

 

5)      Кобзев Виктор Федорович

Институт цитологии и генетики СО РАН,

630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10

 

6)      Князев Сергей Павлович

Новосибирский государственный аграрный университет,

630039, Новосибирск,  ул. Добролюбова, 160

 

7)      Гончаренко Галина Моисеевна

Cибирский научно-исследовательский и проектно-технологический институт животноводства СО РАСХН,

630501, г. Краснообск Новосибирской области

 

8)      Бекенёв Владимир Алексеевич

Cибирский научно-исследовательский и проектно-технологический институт животноводства СО РАСХН,

630501, г. Краснообск Новосибирской области

 

9)      Юдин Николай Серафимович

Институт цитологии и генетики СО РАН,

630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10

 

Адрес для переписки

Юдин Николай Серафимович

Институт цитологии и генетики СО РАН,

630090, Новосибирск, пр. Лаврентьева, 10

e-mail : yudin@bionet.nsc.ru

тел. (3833) 333118 (сл.), (3832) 339864 (дом.)