Удк 591.111:636.293+576858 (04)

 

 

©  Гусев Б.Н., Жунушов А.Т., Алеева А.Ж.

 

Результаты исследования сыворотки крови яка

для биотехнологии (Сообщение 1)

 

 

В статье изложены предварительные исследования о возможности использования сыворотки крови яка для выращивания культур клеток и вирусов. Разработана методика гуманного обескровливания яка под местной анестезией. Показано, что биохимические показатели сыворотки крови яка аналогичны средним данным сыворотки крови человека, лошади и крупного рогатого скота, отличаясь более высоким содержанием железа (1-3 раза) по сравнению с сывороткой крови крупного рогатого скота и в 2-4 раза – низким содержанием билирубина, по сравнению с сывороткой крови человека.

Ростовые качества сыворотки выше, а неспецифические ингибиторы ниже, что дает возможность рекомендовать сыворотку крови яка для выращивания культур тканей, клеток и вирусов.

 

 

Метод культур тканей и клеток животных и человека в последнее время широко применяется в научных исследованиях, особенно – вирусологических, в клинике, в частности, для выращивания аутотрансплантатов кожи, а также в биологической промышленности для изготовления диагностических, профилактических препаратов и получения физиологически активных веществ в крупномасштабном производстве. Для выращивания и поддержания культур тканей и клеток используют, как известно, питательные среды, которые условно можно разделить на естественные, основой которых являются солевые растворы Эрла или Хэнкса, и среды из химически определенных веществ – МЕМ, RPMI 1640, 199 и др. весьма сложного состава. Последние содержат почти все аминокислоты, витамины, некоторые предшественники нуклеиновых кислот, факторы роста и источники липидов. Однако, несмотря на сложность состава, обязательным компонентом всех питательных сред является сыворотка крови сельскохозяйственных животных или человека. Чаще всего в среды добавляют сыворотку крови крупного рогатого скота (КРС), лошадей, овец и свиней.

Цель исследования. Изучить возможность использования сыворотки крови яка в ростовой и поддерживающей среде для выращивания культур клеток и вирусов, так как физиологические особенности организма яка приспособлены к резко континентальному климату высокогорья. Экологическая чистота зоны его обитания предполагает и высокую питательную ценность сыворотки крови.

 

Материал и методы. Забор крови проводили от клинически здоровых якоматок в возрасте 3 года (урочище Арчалы Тонского р-на Иссык-Кульской области, высота 2700 м н.у. моря) при тотальном обескровливании из яремной вены через канюлю в стерильные стеклянные цилиндры. Для этого разработана методика гуманного обескровливания животных под местной анестезией. Сыворотку крови отделяли от белково-эритроцитарного сгустка и осветляли по общепринятой методике в асептических условиях. Стерилизовали сыворотки фильтрацией под давлением через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Для контроля стерильности сыворотки высевали на мясопептонный бульон, питательный агар, среду Киттароцци, агар Сабуро.

В качестве тест-объектов использовали перевиваемую линию клеток тестикул теленка "ТТ" и адаптированный к ней вакцинный штамм вируса оспы овец "НИСХИ".

Биохимические и клинические показатели сывороток крови яка определяли экспресс-методами: общий белок – биуретовым; билирубин – по Йендрашеку; глюкозу – ферментативным; кальций -о- крезолфталеинкомплексом; гемоглобин – цианидным; железо – с хромазуролом.

Исследования проводили в сравнении с сывороткой крови крупного рогатого скота, изготовленной аналогичным способом. До исследования сыворотки крови хранили при минус 27^оС.

Результаты исследований. Биохимические и клинические показатели сывороток приведены в табл.1.

Как установлено, сыворотка крови яка по количеству общего белка, глюкозы, гемоглобина, кальция и рН не отличалась от средних показателей сывороток крови человека, лошади и КРС. По содержанию железа сыворотка крови яка была близка к сыворотке крови человека, в то время как в сыворотке крови КРС концентрация в 1,5-2 раза оказалась ниже, а билирубин, как общий, так и прямой – в 2-4 раза ниже, по сравнению с сывороткой крови человека.

Ростовые качества сыворотки крови яка, в сравнении с сывороткой крови КРС, определяли визуальным контролем за сроками формирования монослоя клеток "ТТ", и в динамике – прямым подсчетом клеток, окрашенных кристалвиолетом в камере Горяева по срокам инкубации. С поверхности культуральных сосудов клетки снимали 0,02% раствором версена.

Визуально полноценный монослой клеток в питательной среде 199 с 3% сывороткой крови яка формировался между 72 и 96 часами культивирования: в среде с 3% сывороткой крови КРС – на 1-2 суток позже и лишь на седьмые сутки в опыте и контроле количество клеток достигало одинаковых показателей.

       Ростовые питательные среды содержали минимальное количество исследуемых сывороток (3%), так как низкая концентрация позволила более четко выявить различия.

 

Таблица 1

Биохимические показатели сыворотки крови яка, крупного рогатого скота, лошади и человека

 

 

Примечания - нет сведений.

Динамика размножения клеток "ТТ" в средах с сыворотками яка и КРС приведена на рис.1

 

Рис. 1. По оси ординат – количество клеток в тыс./мл в средах с сыворотками: ряд 1 – яка; ряд 2 – КРС. По оси абсцисс – время инкубации клеток в часах.

 

Неспецифические ингибиторы вируса определяли по разнице титров вакцинного штамма вируса оспы овец после инкубации вируссодержащей жидкости в течение 1 часа при 37^оС с 20% испытуемых сывороток. В контроле вируссодержащую жидкость инкубировали в тех же условиях с 20% среды 199.

Титр вируса в контроле и в опыте с сывороткой крови яка был равным и составил 5,0 lg ТЦД₅₀/мл. Сыворотка крови КРС оказалась более токсичной и по сравнению с контролем титр вируса понизился на 0,5 lg ТЦД₅₀/мл, т.е. в абсолютных цифрах произошла ингибиция вируса на 50%.

Обсуждение и выводы. По основным биохимическим и клиническим тестам сыворотка крови яка отличается от сыворотки крови человека более высокой концентрацией железа и глюкозы, но пониженным содержанием как общего, так и прямого билирубина. Выраженные ростовые свойства и низкое содержание неспецифических ингибиторов дают основание рекомендовать сыворотку крови яка для применения в биотехнологических целях для выращивания перевиваемых линий клеток и вирусов.

 

        Литература

 

1.        Антонова В.Я., Блинова П.Н. Лабораторные исследования в ветеринарии. –М.: Колос, 1971.

2.        Колб В.Г., Камышников В.С. Клиническая биохимия. – Минск: Беларусь, 1976.

3.        Меньшикова В.В. Лабораторные исследования в клинике. – М.: Медицина, 1987.

 

 

 

 

 

Статьи рекомендованы членом

редколлегии академиком НАН КР

Акималиевым Дж