Поиск ПЦР-системы оптимальной для скрининговых технологий контроля болезни Марека
Афонюшкин В.Н, Городов В.С., Юшков Ю.Г.
Сектор болезней птиц, ГНУ ИЭВСиДВ
В последнее десятилетие
отмечается резко возросший интерес к болезни Марека. Связанно это с резким
снижением эффективности противоэпизоотических мероприятий, в частности
вакцинаций, омоложением инфекции (начинает поражаться более молодая,
вакцинированная птица), появлением высокопатогенных шатммов (vv+), повышается восприимчивость к
болезни у взрослых кур. Данные
изменения, связанные с возросшим полиморфизмом вируса, предъявляют новые
требования к системе диагностических мероприятий предназначенной для анализа эпизоотической
ситуации, разработки системы противоэпизоотических мероприятий, контроля за их
эффективностью, поиска новых средств борьбы с инфекцией
Актуальность темы в
экономическом аспекте связана с одной стороны с тем, что птицеводство является
флагманом сельского хозяйства в экономическом смысле этого слова, с другой
стороны изменения произошедшие за последние годы – появление высокопатогенных
штаммов вируса болезни Марека поражающих молодняк, неэффективность вакцин
наносят достаточно большой ущерб и в перспективе могут представлять еще большую
угрозу ввиду высокой скорости генетической изменчивости вируса.
1.1.
Материалы и
методы.
Исследования проводились в секторе болезней птиц лаборатории оптимизации противоэпизоотических систем ГНУ ИЭВСиДВ.
Построение
компьютерных моделей разрабатываемых тест-систем осуществлялось с
использованием программных пакетов “Lasergene” “Vector NTI Suite
6.0”. Нуклеотидные последовательности герпесвирусов были получены из
международных баз данных “GENBANK”
и “NCBI”.
Для тестирования специфичности и чувствительности использовали вакцинные штаммы ВБМ 1-го (Rispens), 2-го и 3-го (ФС-126) серотипа, вакцинный штамм ILT, также в качестве негативных контролей использовали препараты нуклеиновых кислот различных вирусов и бактерий S.typhimurium, S. Enteritidis, E. Coli (штаммы: JM-109/PCI-neo, JM -103/puc18, ATCC 124582), препараты геномной ДНК птицы содержащей ДНК сальмонелл, аденовирусов. Объектом исследования служили внутренние органы кур различных возрастов из птицефабрик с различной эпизоотической ситуацией.
ПЦР проводили с использованием комплектующих «GENPAQ» «Amplisens» с добавлением собственных праймеров на амплификаторе «Терцик» (Ausubel F.M. 1987).
Выделение ДНК проводили стандартным методом с использованием набора «ДНК сорб Б» фирмы «Amplisens». А также по оригинальной методике (см. ниже).
Электрофорез продуктов ПЦР проводили в
1.7% геле агарозы ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали с
использованием трансиллюминатора “Vilber Lourmat” с использованием системы компьютерного анализа
изображений “Gel Imager”.
Точное
определение размеров ПЦР продуктов осуществляли путем разгонки методом
вертикального электрофореза в 2% ПААГ и последующим расчетом с использованием
программы “Gel Analiser”
(Остерман А.Л. 1988).
Получение ДНК зондов осуществляли путем синтеза ПЦР продукта на матрице смеси вакцинных штаммов ВБМ 2-го и 3-го серотипов входящих в состав вакцины «Бимарек» производства ВНИИЗЖ.
Для синтеза
зондов использовали 2 различные ПЦР системы и разные метки (ТАМРА и BIO-d-UTP).
На стадии
тестирования зондов использовали метод дот-блот-гибридизации (Херрингтон С. 1994).
Изучение
полиморфизма различных участков гена А антигена
Анализ алигментов
последовательностей гена А антигена ВБМ различных серотипов с помощью программы
Align X, по методу Kimura, Takaguchi (1980), показывает
неоднородность консервативности различных участков этой группы полипептидов,
см. рис 1.
Рис.1
Диаграмма гомологии нуклеотидных
последовательностей гена А антигена ВБМ, график 1 – усредненная, график 2 – по
выровненным последовательностям, график 3 – относительно эталонной
последовательности штамма ВБМ ФС-126
Как видно из алигмента
последовательностей выровненных по алгоритму «Klustral W», практически все последовательности
отличаются даже по размерам, за счет инсерций и делеций, таким образом помимо
генетического полиморфизма, возможен еще более выраженный полиморфизм на уровне
структуры протеинов, за счет сдвига рамок считывания (рис. 2).
Рис.
2 Построение алигмента по имеющимся в распоряжении последовательностям
расчетной зоны амплификации
Таким образом, именно «А
антиген» обладает оптимальным сочетанием высоко и низкоконсервативных участков
ДНК позволяющих подобрать праймеры на высококонсервативные зоны и в то же время
получить ампликоны обладающие высоким полиморфизмом последовательностей, что
дает предпосылки использования ампликонов для изучения генетического
полиморфизма вирусов.
В соответствии с проведенными исследованиями, была поставлена задача – произвести подбор праймеров имеющих высокую температуру отжига и высокий полиморфизм последовательности ампликона.
В процессе построения моделей ПЦР с использованием программ Prime Premier 5.0, Primer Select была отобрана одна пара праймеров локализующаяся в необходимом участке и характеризующаяся оптимальными характеристиками.
Рис.3
Образуемые димеры
Праймеры характеризовались незначительным количеством образующихся димеров, причем отсутствовали связи между нуклеотидами G и С локализующиеся попарно, что значительно снижало прочность димеров (см. рис 3).
Самокомплементарность (хайрпинсы) была слабо выражена у обоих праймеров, причем превалировали связи преимущественно между А и Т (см. рис 4). При температуре отжига такие связи не могут быть стабильны как в отношении димеризации так и самокомплементарности.
Рис.
4 Случаи самокомплементарности типа голова- хвост
Рис. 5 содержание GC- связей в зонах отжига праймеров.
Как следует из графика №5
стабильность и высокая температура отжига праймеров обеспечивается как высоким
содержанием нуклеотидов типа G
и C, а также короткими
последовательностями поли-А, поли-Т что особенно актуально в 3l концах праймеров.
В целом данные анализа dG и темепратуры плавления цепей ДНК в локусах
отжига праймеров позволяют прогнозировать высокую температуру отжига для
использования разработанной ПЦР системы в различных перспективных направлениях
генодиагностики и анализа генного полиморфизма ВБМ.
Низкая самокомплементарность
и минимальное количество гетеродуплексов, а также незначительное количество
сайтов неспецифического отжига в геноме ВБМ обеспечивают эффективность
использования праймеров в ПЦР смеси, что необходимо для обеспечения высокой
чувствительности и специфичности метода.
Структура исследований заключалась в выявлении
максимальной температуры отжига праймеров при которой сохранялся эффективный
синтез ампликона соответствующих размеров на ДНК различных генотипов ВБМ. Для
этой цели использовали ДНК выделенную из вакцинных штаммов 1-го, 2-го и 3-го
серотипов. В качестве отрицательного контроля использовали ДНК вируса
инфекционного ларинготрахеита.
Всего проверили следующие температуры отжига: 46, 48,
50, 52, 55, 58, 60, 62, 63, 64, 65 оС. В диапазоне температур 46-55
оС отмечались неспецифические реакции и обилие лишних полос на
электрофореграмме. Температура 65 оС
являлась критической для отжига праймеров. Достаточно интенсивный синтез
ампликона наблюдался при температуре 63 оС и ниже.
В
ходе исследований была подобрана следующая программа амплификации см. табл 1:
Табл.1 Программа амплификации ПЦР на ген А антигена ВБМ
|
этап |
температура С |
число циклов |
время, мин |
|
1 |
95 |
1 |
пауза |
|
2 |
95 |
1 |
5 |
|
3 |
95 |
40 |
1 |
|
63 |
40 |
1 |
|
|
72 |
40 |
1 |
|
|
4 |
72 |
1 |
5 |
Рис.6 Электрофореграмма 1: (Марек -358 п.н.)Трек 1- отрицат. контроль, трек 2 - 1 серотип вакцинный штамм “Rispens”, трек 3 ИЛТ (вакцинный штамм),трек4 -2+3 серотип вакцина «Бимарек»,трек 5- кровь курицы, трек 6 -отрицательный контроль, трек 7 - маркер 730, 625, 140 п.н.
Заключение: В ходе работы были получены
следующие результаты:
1. В процессе работы подобраны фрагменты генома вируса болезни Марека (ВБМ) оптимальные для изучения полиморфизма различных штаммов и изолятов ВБМ методами генотипирования
2. Получен лабораторный образец ПЦР-системы предназначенной для индикации гена А антигена ВБМ 1, 2 и 3-го серотипов, отличающийся высокой температурой отжига праймеров, предназначенный для синтеза ДНК-зондов, изучения генетического полиморфизма ВБМ и количественной оценки содержания вируса в различных биологических объектах.