УДК 619:616.981.49

 

Влияние аэрогенного и перорального введения аминогликозидов птице на формирование антибиотикорезистентности условно-патогенной микрофлоры кишечника.

 

 

Афонюшкин В.Н., Юшков Ю.Г., Коптев В.Ю., Чупахина Н.В.

ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, г.Новосибирск

Степнов В.А.

ОАО ПФ «Новосибирская бройлерная», г.Искитим

 

Проблема возникновения устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам с годами не только не решается, но, напротив становиться все более острой. По нашему мнению стратегия борьбы с этим явлением не может основываться только лишь на поиске новых антибактериальных веществ. Совершенствование технологии применения антибиотиков, более гибкое и целенаправленной использование антибактериальных веществ - несомненно, один из элементов профилактики возникновения антибиотикоустойчивости микроорганизмов.

 Аминогликозиды характеризуются довольно, широким спектром антибактериальной активности и отличаются медленной адаптацией к ним микроорганизмов. В то же время такое свойство - как незначительное всасывание в желудочно-кишечном тракте птицы наряду с несомненными плюсами (сокращение срока карренции, локальное действие в зоне желудочно-кишечного тракта) имеет и минусы - а именно при пероральном введении сложно довести препарат до других органов и систем.

Целью нашей работы являлось изучение роли аэрогенного и перорального путей введения аминогликозидов (на примере гентамицина) на условно-патогенную микрофлору кишечника и устойчивость ее представителей к антибиотикам.

Материалы и методы:

Структура эксперимента. Объектом исследования служила с/х птица мясного направления кросса ИЗА.

Птица 12 дневного возраста была разбита на 3 группы: контрольная (интактная), группа 1 - получала апрамицин с водой в дозе 50 мг/кг массы тела в течение 3-х дней. Группа 2-проходила аэрозольную обработку гентамицином.

По истечении срока эксперимента осуществляли убой 10 голов птицы с каждой группы, отбор проб кишечного содержимого из толстого отдела кишечника (для последующего бактериологического исследования).

В процессе бактериологического исследования анализировали содержание условно-патогенных микроорганизмов в толстом отделе кишечника. Изоляты типировали до вида с использованием систем биохимической идентификации микроорганизмов кишечной группы производства фирмы «Диагностические системы», Нижний-Новгород.

         Изменение чувствительности ассоциаций микроорганизмов оценивали стандартным методом. Путем аппликации на засеянную чашку Петри дисков с антибиотиками. После 24 инкубации при 37 С ^о, производили измерение зон абсолютной задержки роста (полное отсутствие роста бактерий) и зон относительной задержки роста (зона со сниженной активностью роста бактерий проявляющаяся в виде снижения концентрации колоний и/или уменьшением их размеров).

         Также проводили изучение устойчивости выделенных из патогенного материала микроорганизмов к терапевтическим концентрациям коммерческих антибиотиков микропланшетным методом.

Результаты собственных исследований

Как видно из таблицы 1 в целом условно-патогенная микрофлора желудочно-кишечного тракта характеризовалась довольно высокой устойчивостью к широкому спектру антибиотиков. Помимо апрамицина довольно высокой активностью характеризовались такие аминогликозиды как стрептомицин, канамицин и гентамицин. После обработки гентамицином, в обеих опытных группах микрофлора приобрела или повысила устойчивость к канамицину, стрептомицину, тетрациклину. В то же время, зоны задержки роста для некоторых антибиотиков наоборот увеличились: польодоксину, энрофлоксацину, полимиксину. Зоны абсолютной и относительной задержки роста к таким антибиотикам как поллодоксин, офлоксацин, энрофлоксацин были выше в группе обработанной аэрозольно. Следует отметить что размеры зон относительной задержки роста также были довольно хорошо выражены у птицы обработанной аэрозольно, в то время как при пероральном введении апрамицина не отмечалось ни абсолютной ни относительной задержки роста обусловленных этими аминогликозидами (см. табл. 1).

 

Таблица 1 Метод дисков: абсолютные и относительные

зоны задержки роста, мм.

Антибиотик	Контроль		Аэрозоль		Перорально
	Отн.	Абс.	Отн.	Абс.	Отн.	Абс.
Энрофлоксацин	14	-	18	12	-	-
Окситетрациклин	-	-	-	-	-	-
Амоксициллин	7	-	16	-	-	-
Тетрациклин	7	-	-	-	-	-
Поллодоксин	15	15	19	19	17	17
Канамицин	17	17	21	-	-	-
Гентамицин	20	-	26	-	-	-
Офлоксацин	15	14	23	17	17	8
Рифан	-	-	-	-	-	-
Левомицетин	-	-	-	-	-	-
Стрептомицин	14	19	-	-	8	8
Полимиксин	-	-	21	21	18	18
Ампициллин	-	-	-	-	-	-

 

Учитывая тот факт, что диаметр зоны задержки роста не всегда гарантирует достаточную активность антибиотика при введении его в организм птицы в терапевтической концентрации, специалисты нашей лаборатории пользуются альтернативной системой оценки антибиотикорезистентности. Сущность метода заключается в культивировании изолятов и ассоциаций бактерий в лунках микропланшетов с предварительно внесенными антибиотиками в концентрациях эквивалентных терапевтическим. Благодаря этому методу удается решить следующую задачу - способен ли антибактериальный препарат в терапевтической концентрации подавить рост изучаемого изолята?

Другой важной задачей являлось тестирование коммерческих препаратов которые могут быть предоставлены птицефабрике фирмой поставщиком. Поскольку высокая активность чистого антибактериального вещества внесенного в диск, вовсе не гарантирует хорошую работу коммерческого препарата (концентрация действующего вещества, условия хранения и степень разрушения в котором могут сильно варьировать). В данном случае мы использовали препараты поступившие на склад ООО «СибАгроТрейд».

         По результатам подтитровки микрофлоры контрольной группы способностью к подавлению активности роста в терапевтических концентрациях обладали: апрамицин, зинаприм, квинабик, коливет и эриприм (см. табл. 2). То есть количество бактерий в лунках с этими антибиотиками было значительно меньше, чем в лунках без антибиотиков. Степень подавления роста бактерий замерялась вертикальным спектрофотометром и рассчитывалась с помощью программных продуктов разработанных в нашей лаборатории.

Таблица 2. Процент задержки роста антибиотикорезистентных (R) микроорганизмов, выделенных от птицы контрольной группы, в присутствии тестируемых антибиотиков

микрофлора	антибиотики
	энрофлоксацин	апрамицин	энроколи	зинаприм	эриприм	квинабик	коливет	амоксициллин	фуразолидон	рифан	гентамакс
энрофлоксацин R	2,9	79,9	-2,4	20	81,1	80,8	80,8	-4,3	-4,8	3,9	22,2
доксициклин R.	-10,	71	-10,8	54,3	77,8	77,5	79,5	73,9	-7,2	-2,5	21,9
амоксицилин R.	12,2	82,9	15,	47,9	81,9	81,3	83	25,8	17,7	20,4	36,8
амоксиклав R.	-4,	41	-1,1	-0,6	73,6	71,6	74,7	-9,8	-6,8	-18,5	12,8
апрамицин R.	7,6	39,7	-11,2	24,5	75,8	59,8	77,9	-10,8	-7,4	-2,5	25,1
ципрофлоксацин R.	9,1	79,1	-8,1	36,4	80,8	79,7	79,8	3,5	0	-3,9	24,
стрептомицин R.	80,9	81,4	-5,8	80,2	77,4	78,9	79,8	-3	3,4	0,2	79,5
Контроль (интактная .микрофлора)	12,8	79,4	-10,2	13	80	75,9	75,4	-8,7	-6,7	-1,5	16,4

 

Компактность и эргономичность метода позволила прогнозировать перекрестную антибиотикорезистентность непосредственно для каждой исследуемой пробы (см. табл. 3).  Под перекрестной антибиотикорезистентностью подразумевается повышение устойчивости бактерий к антибиотику после обработки другим антибактериалным веществом.

В данном опыте культура обработанная апрамицином in vitro характеризовался довольно умеренным повышением антибиотикорезистентности (на 10%) к нему же, а также к квинабику (см. табл. 3). По нашим наблюдениям быстрое снижение активности антибиотика более чем на 40% может обусловить неэфективность его применения.

Таблица 3 Изменение постантибиотической антибиотикорезистентности, %

	антибиотики
м.ф.	энрофлоксацин	апрамицин	энроколи	зинаприм	эриприм	квинабик	коливет	амоксициллин	фуразолидон	рифан	гентамакс
энрофлоксацин чувств.	0	30,4	7,7	7	1	4,9	5,4	4,3	1,8	5,5	5,7
доксициклин R.	-12,8	21,6	-0,6	41,2	-2,2	1,6	4,1	82,7	-0,5	-0,9	5,5
амоксицилин R.	9,4	33,4	25,2	34,8	1,8	5,3	7,5	34,5	24,4	22,	20,3
амоксиклав R.	-46,9	-8,4	-20,9	-13,7	-6,4	-4,2	-0,6	-1,1	-0,1	-16,9	-3,5
Апрамицин R.	4,7	-10,2	-1	11,4	-4,1	-16	2,5	-2,1	-0,6	-0,9	8,6
ципрофлоксацин R.	6,3	29,7	2,1	23,3	0,7	3,8	4,4	12,2	6,7	-2,3	7,5
стрептомицин R.	78	31,9	4,3	67,1	-2,6	3	4,4	5,7	10,1	1,7	63

 

Таблица 4 Процент задержки роста антибиотикорезистентных (R) микроорганизмов, выделенных от птицы обработанной аэрозолем, в присутствии тестируемых антибиотиков

Процент задержки роста в присутствии тестируемых антибиотиков
проба	антибиотики
	энрофлоксацин	апрамицин	энроколи	зинаприм	эриприм	квинабик	коливет	амоксициллин	фуразолидон	рифан	гентамакс
азлокацин	66	66	20,4	51,4	64,4	66,8	23,4	-58,2	-16,5	38,1	67,5
канамицин	71,9	-0,3	-4,6	32,6	62,7	71,3	-3,4	13,9	-9,4	15,8	28
энрофлоксацин	61,9	65,3	0,8	55,3	64,3	62,4	13	5,3	-15,8	1,7	23
офлоксацин	70,2	71,1	47,1	65,5	69,4	61,5	32,9	49,	24,1	25,7	25,1
польодоксин	71,1	70,4	4,9	27,3	63,8	70,6	18,7	3,5	8,5	15,1	70,4
гентамицин	39,7	40,8	3,5	52,5	69,7	72,3	21,4	15	2,1	8,8	10,3
амоксициллин	70,4	72,7	-0,2	35,9	63	69,6	20	34,9	9,6	7,9	10,5
Контроль (интактная микрофлора)	75,9	74,2	21,3	46,2	66,6	72,6	32,5	9,9	0,4	8,6	75,6

 

Таблица 5. Процент задержки роста антибиотикорезистентных (R) микроорганизмов, выделенных от птицы получавшей аминогликозиды перорально, в присутствии тестируемых антибиотиков

Процент задержки роста в присутствии тестируемых антибиотиков
проба	антибиотики
	энрофлоксацин	апрамицин	энроколи	зинаприм	эриприм	квинабик	коливет	амоксициллин	фуразолидон	рифан	гентамакс
польодоксин	61,1	-0,9	3,0	20,3	25,2	71,3	72,2	72,2	1,8	46,2	33,2
гентамицин	47,9	3,9	0,1	22,3	66	61,1	71,7	72,4	6,2	-12,6	16,3
офлоксацин	-0,3	11,8	9,8	54,3	69,3	59,8	70	70,1	-9,5	-11,5	19,2
энрофлоксацин	-0,1	6,6	-1,8	42,3	68,3	60	68,7	68,2	-5,6	-7,5	45,1
азлокацин	10,2	-8,6	-5,6	1,5	7,1	-11,2	3	4,5	-1	-1,2	-2,5
канамицин	-5,7	-1,2	-1,9	-2,6	26	-3,1	23,9	1,6	-2,	-1,4	-1
амоксициллин	49	7,8	3,9	15,7	69,2	55,4	72,5	71	-1,1	0,3	0,3
Контроль (интактная микрофлора)	18,4	-5,6	-4,5	-1	8,4	27,8	63,3	63,9	-1,3	-1,1	44,5

 

 

Заключение: Изучение антибиотикограмм у птицы опытных групп позволило обнаружить низкую чувствительность к аминогликозидам кишечной микрофлоры выделенной у птицы получавшей данный препарат перорально (что вполне закономерно), и, довольно высокую чувствительность тех же микроорганизмов у птицы получившей препарат аэрозольно.