УДК 579.252.56:615.332

 

Дискриминация  штаммов некоторых таксономических единиц семейства энтеробактерий по биохимическим характеристикам с использованием кластерного анализа и базы данных.

 

к.б.н. Афонюшкин В.Н. (lisocim@mail.ru ), к.в.н. Коптев В.Ю., Нестерова И.С. (ГНУ ИЭВСиДВ), Е.К.Табатчикова (МСХА 1шк.)

 

Нашей целью было разработать приложение базы данных Access для обработки результатов биохимического типирования энтеробактерий.

Материалы и методы.     Исследования проводились в лаборатории болезней птиц. Написание базы осуществлялось на языке MS SQL JET. Структура базы данных строилась на основе системы биохимического анализа энтеробактерий ПБДЭ, производство Н-Новгород.  Полученные данные кодировались и после проверки соответствия имеющиеся изоляты использовали для различных методов кластерного анализа.

Результаты исследований.

Разработка базы данных. База данных «энтеро 3» предназначена для хранения и обработки биохимических характеристик выделяемых изолятов и депонированных штаммов микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. На данном этапе работы основным модулем базы является банк данных биохимических характеристик тестируемых на основе системы ПБДЭ для идентификации выделяемых из тестируемого материала культур

Концепция использования биохимических тестов для идентификации вида микроорганизма Автоматизированная обработка результатов биохимических тестов обычно подразумевает 2 подхода:

1-       Кодирование результатов биохимических исследований и сопоставление с имеющимися в различных справочниках и банках данных кодами (но к сожалению эти банки данных пока недостаточно полны).

2-       Вероятностный подход заключающийся в выборе нескольких видов характеризующихся той или иной степенью совпадений с эталонными штаммами.

Наша концепция заключается в сочетании этих подходов.

В случае ненахождения 100% соответствия выделенного изолята по биохимическим свойствам, с каким либо штаммом банка данных.  Мы проводим серию последовательных фильтраций по исследуемым характеристикам с учетом их значимости и внутривидовой вариабельности.

Мы считаем недопустимым использование вероятностного подхода основанного на наибольшем проценте совпадений результатов биохимических тестов с эталонным штаммом, хотя этот подход вполне уместен для изучения внутривидовой вариабельности бактерий.

Например, учитывая преимущественную негативность мутаций, вероятность появления нового биохимического признака, намного ниже, чем его исчезновение т.е. для образования ацетилметилкарабинола E.coli необходимо возникновение несколиких новых генов, в то время как для прекращения ферментации лактозы достаточно одной точечной мутации.

Тестирование базы данных на полевых изолятах выделяемых от с/х птицы  Оценивали следующие биохимические свойства: Утилизация цитрата, малоната, глюкозы, лактозы, маннита, сахарозы, инозита, сорбита, арабинозы, мальтозы, фенилаланина, образование индола, сероводорода, ацетилметилкарабинола (Реакция Фогес-Проскауэра), наличие бета-галактозидазы, уреазы, декарбоксилаз аргинина и лизина, гидролазы аргинина. Полученные данные кодировали и код вводили в базу данных для поиска соответствия в банке данных и нахождения вида и штамма микроорганизма. В ряде случаев были обнаружены новые штаммы обладающие всеми биохимическими характеристиками вида но не имеющие аналогов в банке данных.

Как показали результаты кластерного анализа внутривидовая биохимическая вариабельность отличается большим размахом биохимических характеристик. Так 3 изолята кишечной палочки образуют один кластер, в то время как разброс биохимических характеристик С. amalonaticus по евклидовым дистанциям превышает даже межвидовые различия этих характеристик.

Изучение внутривидового биохимического полиморфизма в системе молекулярно-эпизоотологических исследований

Достаточно высокая вариабельность биохимических характеристик внутри вида E.coli создает предпосылки для использования биохимических критериев с целью дискриминации штаммов внутри вида, и, соответственно для целей молекулярной эпизоотологии и экологии E.coli. На начальном этапе исследований, методом Two-way Joining, были выявлены наиболее и наименее вариабельные биохимические критерии. Наибольшей вариабельностью обладает часть кода, зависящая от активности декарбоксилаз орнитина и лизина, а также гидролазы аргинина. К наиболее консервативным биохимическим свойствам следует отнести выделение сероводорода, ферментацию глюкозы, арабинозы и мальтозы, цитрата и малоната натрия а также глюкозы в присутствии цитрата В виду того, что максимальный уровень кластеризации выделенного пула изолятов достигается при использовании в кластерном анализе всех биохимических свойств, в исследованиях использовали 7 кодов отражающих 21 биохимический признак E.coli. Попытка сравнить различные изоляты E.coli внутри одного серотипа, помимо значительных биохимических различий внутри этого серотипа, в подавляющем большинстве случаев показали отсутствие идентичности между этими изолятами. В то же время кластеризация всего пула изолятов показывает их группировку по биохимическим признакам вне взаимосвязи с источником выделения. По нашему мнению, данный феномен отражает 2 факта: во-первых, в однородных популяциях макроорганизмов-хозяев существует широкий спектр разных биотипов E.coli, различающихся по биохимическим свойствам даже внутри серотипа, во-вторых, встречающиеся совпадения биохимических характеристик изолятов выделенных из различных источников, например 2 изолята из 1 и 2 группы (телята и коровы) и 2 изолята из 1 и 4 группы (телята - люди) по нашему мнению свидетельствуют о циркуляции E.coli изучаемого серотипа между крупным рогатым скотом и людьми и достаточно хорошей приживаемости в течение длительных сроков у телят и коров.

Заключение:

1- В ходе работы были получены следующие результаты: Собран банк данных биохимических характеристик E.coli, E agglomerans, S.luminescens (особенности белкового и углеводного обмена у различных биотипов). Разработана структура хранения и обработки данных.

2- Разработан интерфейс компонентов базы данных предназначенных для пополнения банка данных биохимической вариабельности различных видов микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae

3- Использование кодов отражающих биохимические характеристики энетробактерий в кластерном анализе позволяет проводить сложные молекулярно-эпизоотологические и экологические исследования

 

 

Discrimination of the strains some units of taxon  of the set Enterobacteriaceae under the biochemical performances with usage of cluster analysis and BD "Access".

 

We consider to invalid usage of the probability approach grounded on greatest percent of concurrences of results of the biochemical tests with the standard strain, though this approach is quite pertinent for analysis intraspecific varyabiliti of bacterias.

For example, allowing preferential negativity mutations, odds of appearance of the new biochemical sign, much below, than his vanishing i.e. for formation acetilmethikarabinol E.coli is necessary originating some of new genes, while one dot mutation suffices for termination of fermentation of lactose.

Summary:

1-       During operation the following results were obtained: the data bank of the biochemical performances E.coli, E agglomerans, S.luminescens (feature of proteinaceous and carbohydrate interchanging for different species) Is collected. The pattern of stowage and data processing is designed.

2-       The interfacing of reductants of the database intended for replenishment of a data bank biochemical variability of different aspects of micro-organisms of the set Enterobacteriaceae is designed

3-       Usage of codes reflective the biochemical performance энетробактерий in cluster analysis allows to conduct composite молекулярно-эпизоотологические and ecological analysiss.