Адаптация колориметрического метода определения альбумина в сыворотке крови птиц реакцией с бромкрезоловым зеленым  к микропланшетному формату и оценка его диагностической ценности.

 

Афонюшкин В.Н., Дударева Е.В., Толегенова В.Т.

ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

 

Альбумин – белок вырабатываемый печенью. Его снижение возможно при наличии воспалительных процессов (отрицательный белок острой фазы), нарушении белоксинтетической функции печени, поражении почек.

Если этого белка мало – резко повышается чувствительность организма птицы к токсинам. В сочетании с информацией о токсичности корма, уже можно использовать эту диагностическую информацию, ведь в данном случае птица может отравиться кормами, не имеющими превышения ПДК по токсинам  (Луйк А.И., Лукьянчук В.Д. 1984; Russel R.W., Overstreet D.H. 1987; Teraki Y., Maemura S. 1990; Абдувахабов А. А., Михайлов С.С., Садыков А. С. , Щербак И. Г. ,1989).

 

Материалы и методы

Реактивы: монореагент готовится следующим образом

1. Уксусная кислота в колбу на 1л приливают 60мл ледяной уксусной кислоты и доводят до метки дистиллированной водой

2. Едкий натр, ч.д.а. 1моль/л

3. Ацетатный буфер 0,05 моль/л, рН4,2 с добавлением детергента

0,85г полигидроксиэтиленлаурилового эфира (Brij-35) расторяют в 200мл дист. воды

добавляют 50мл 1моль/л уксусной кислоты, 13.2 мл 1моль/л раствора едкого натра и доводят объем дистиллированной водой до 1 л. Перемешивают, контролируют рН. Реактив стабилен при хранении в холодильике

4. Бромкрезоловый зеленый водорастворимый, ч.д.а.-индикатор

1.2ммоль/л 0,4292г БКЗ растворяют в 200-300мл дистиллированной воды в мерной колбе на 500 мл и доводят объем до метки. Реактив стабилен в посуде из темного стекла

5. Рабочий раствор БКЗ в ацетатном буфере. В мерную колбу емкостью 1л помещают 85мл 1.2ммоль/л БКЗ доводят объем до метки ацетатным буфером с детергентом. Раствор стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла

Альбумин развести до 30 г/л можно добавить азид натрия

Методика постановки:

Материал: сыворотка или плазма крови

Анализ: в 1-ые две лунки планшета вносят по 6 мкл калибратора, в 3-4 ю – 6 мкл дистиллированной воды, в остальные лунки – по 6 мкл исследуемых проб.

Затем во все лунки вносят по 250 мкл рабочего реагента,

Инкубируют 10 мин при 18-25 ^оС, окраска стабильна в течение 3 часов.

Оптическую плотность измеряют при длине волны 650 нм.

Расчет концентраций с использованием программного обеспечения ГНУ ИЭВСиДВ

Результаты собственных исследований

Структура исследований заключается в определении оптимальных параметров реакции таких как соотношение реагент-проба, концентрация калибратора, объем реакционной смеси, температура и длительность реакции, линейная зависимость оптической плотности от концентрации определяемого вещества.

Объем реакционной смеси устанавливался исходя из вместимости лунок микропланшет фирмы «МЕДПОЛИМЕР» т.е. до 300мкл.  Критерием оптимального соотношения реагент-проба служила оптимальная линейность в диапазоне наиболее часто встречающихся, в клинической практике, концентраций субстрата. При подборе этих параметров отдавалось предпочтение максимально большим объемам пробы и реактивов в связи с тем, что при увеличении объема дозирования уменьшались погрешности дозирования.

Разработка условий реакции для микропланшетного метода определения концентрации альбумина в сыворотке крови.

Определение оптимального соотношения реагент-проба при различных длинах волн. Структура экспериментов заключалась во внесении растворов альбумина концентраций 70, 35, 17.5, 8.75 г/л в различных объемах от 1 до 7 мкл. После внесения монореагента и инкубации осуществляли фотометрирование планшет при светофильтрах 650 и 530 нм (см. табл№№ 1 и 2).

 

Таблица 1. Изучение оптической плотности реакционных смесей в зависимости от концентрации альбумина и объема пробы при длине волны 650 нм

Объем пробы	Концентрация альбумина
	70 г/л	35 г/л	17,5 г/л	8,75 г/л
1мкл	0,2	0,107	0,084	0,081
2мкл	0,207	0,159	0,1	0,09
4мкл	0,319	0,222	0,146	0,108
6мкл	0,381	0,267	0,176	0,12
7мкл	0,435	0,293	0,203	0,142

 

Таблица 2. Изучение оптической плотности реакционных смесей в зависимости от концентрации альбумина и объема пробы при длинне волны 530 нм

объем пробы	Концентрация альбумина
	70 г/л	35 г/л	17,5 г/л	8,75 г/л	0 г/л
1мкл	0,187	0,142	0,138	0,131	0,039
2мкл	0,188	0,17	0,142	0,14	0,04
4мкл	0,233	0,195	0,16	0,147	0,039
6мкл	0,251	0,213	0,169	0,153	0,032
7мкл	0,278	0,226	0,187	0,161	0,038

 

 

 

На основе анализа линейности теста выбирали оптимальное соотношение реагент-проба.

Рис.1 Оценка линейности теста при различных объемах пробы и длине волны 650 нм

 

Так сравнивая графики линейности можно отметить более высокую линейность при увеличении объема пробы и больший угол наклона при длине волны 650 нм.

 

 

 

Рис.2 Оценка линейности теста при различных объемах пробы и длинне волны 650 нм

 

 

Таким образом наиболее оптимальное соотношение реагент-проба 41.6:1 а объем пробы 7 мкл (см. рис3).

 

Рис.1 Оценка линейности теста при соотношении реагент проба 41.6:1  и длинне волны 650 нм

 

Анализ линейности показал что постановка реакции в разработанной нами модификации обеспечивает линейность минимум от 70 до 8.75 г/л.

Проверка воспроизводимости осуществлялась путем постановки серии реакций на разных микропланшетах в разные дни всего было сделано 4 повторности по 4 реакции на каждой планшете.

На основании результатов тестирования предложенного метода установлено, что при оценке воспроизводимости теста отклонения результатов не превышали 7% (см. табл4).

Правильность определения концентрации альбумина данным методом проверена и подтверждена при помощи стандартных растворов «ALBUMIN STANDARD SOLUTIONS» Cat № G3751 (Sigma chemical compani).

Таблица 3. Характеристики точности скрининговых методов

Тест	Линейность	Воспроизводимость (Cv, %)
Определение концентрации мочевой кислоты в сыворотке крови	100-800мкмоль/л	5,4%
Определение концентрации общего белка в сыворотке крови	25-80 г/л	7,2%
Определение концентрации триглицеридов в сыворотке крови	50-400 мг/100мл	4,3%
Определение концентрации глюкозы в сыворотке крови	1-10 ммоль/л	2,4%
Определение концентрации кальция в сыворотке крови	5-12 мг/100мл	6%

 

Примеры использования метода с целью постановки диагноза.

На некоторых птицефабриках Сибирского региона с наступлением весеннего периода, было зафиксировано резкое возрастание частоты встречаемости мочекислых диатезов. Проведение биохимических исследований показало резкое повышение концентрации мочевой кислоты, альбумина и креатинина. При патологоанатомическом вскрытии отмечались признаки висцерального мочекислого диатеза. При диагностическом убое периодически встречалась птица у которой, по мере нарастания ацидоза вследствие прекращения кровообращения, органы и ткани покрывались корочкой солей мочевой кислоты. В таких случаях, при биохимическом исследовании у большей части птицы уровень мочевой кислоты превышал 5мг/100мл, а в отдельных случаях достигал 20мг/100мл. Данный факт свидетельствует о наличии мощных компенсаторных процессов в организме птицы, предотвращающих образование кристаллических форм мочевой кислоты. К сожалению, эти механизмы абсолютно не изучены, и не постоянны, т.к. даже незначительное превышение норм мочевой кислоты в сыворотке крови может сопровождатся развитием клинической формы мочекислого диатеза. В ходе исследований была обнаружена зависимость между концентрацией уровня альбумина и мочевой кислоты.

Так, при средней концентрации мочевой кислоты в группе птицы 6.4+0,2мг/100мл коэффициент коррелляции с уровнем альбумина составлял 0.32, а при более высоких концентрациях мочевой кислоты (8,4+0,18), и проявлении клинических форм висцеральной подагры, коэффициент корреляции соответствовал  0.5

       Высокий уровень креатинина и альбумина позволил предположить нарушение водного обмена, связанное с поражением почек, и действительно при массовых патологоанатомических вскрытиях, была зафиксирована исключительно широкая распространенность поражений почек, достигающая 100%.  Патогистологическими исследованями определили тубулонефроз. А токсикологические исследования кормов позволили позволили выявить этиологическую причину данной патологии.

         Полученные данные позволили предположить что возникновения механизм мочекислого диатеза в данном конкретном случае обусловлен обезвоживанием сопровождающимся повышением концентрации белка и последующим его разрушением до конечного продукта – мочевой кислоты, с целью выравнивания онкотического давления. Дополнительным фактором влияющим на этот процесс может быть и снижение уровня глюкозы в крови в следствие нарушения ее реадсорбции в канальцах почках (по нашим не опубликованным данным).

Другой пример использования теста на альбумин также связан с воздействием микотоксинов на с.-х. птицу. Как следует из таблицы 4 у этой группы птицы падение уровня альбумина сопровождалось наличием довольно значительных уровней триглицеридов в сыворотке крови. Патогистологические исследования подтвердили факт наличия жировой дистрофии, а исследования кормов на наличие микотоксинов позволили установить значительные концентрации Т2 токсина и цитринина.

 

 

 

 

Таблица 4. Биохимические изменения у группы птицы с дистрофическими поражениями печени.

№	кальций г/л		альбумин (г/л)		общий белок г/л			АЛТ (ед/л)		триглицериды г/л
диапазон норм	5	69	13,3	20,65	11	20	12		19	100	400
1	7,32		11,11		16,81		12,16			424,87
2	7,00		11,42		18,12		13,66			922,66
3	7,53		12,91		16,54		13,62			1001,90
4	6,95		11,29		15,57		13,29			0,42
5	7,21		11,60		22,73		12,62			680,72
6	8,06		13,65		20,59		13,04			1012,43
7	7,14		12,04		14,61		13,66			633,93
8	6,50		10,73		17,16		13,06			963,96
9	7,86		11,79		17,91		12,64			736,35
10	7,33		10,30		19,77		12,95			1024,66

 

В данной ситуации тест на альбумин может использоваться для контроля функциональной активности печени, в частности синтетической. Учитывая что методы патологоанатомического мониторинга позволяют адекватно оценивать в первую очередь изменения происходящие у наиболее ослабленной птицы, т.е. их сложно экстраполировать на все поголовье, то прижизненный контроль патологии с использованием клинической биохимии вполне уместен. Например, удобно оценивать применение гепатопротекторов, биологические эффекты токсичных кормов и, естественно восприимчивость птицы к токсинам.

Заключение: в виду того, что в условиях промышленного птицеводства более уместны популяционные подходы к клинико-биохимическим исследованиям, позволяющие в качестве диагностических критериев использовать различные статистические показатели типа кривых распределения, коэффициента вариации, коэффициента корелляции и т.д. постановка биохимических тестов в микропланшетном формате имеет свои перспективы. Тест на альбумин в условиях птицеводства в наибольшей степени востребован для контроля негативного воздействия микотоксинов в кормах.

 

Литература

1. Абдувахабов А. А. , Михайлов С. С. , Садыков А. С. , Щербак И. Г. Антиферментное действие фосфорорганических ингибиторов холинэстераз. - Ташкент.Фан,1989. - 182 с.
2. Луйк А.И., Лукьянчук В.Д. Сывороточный альбумин и биотранспорт ядов. -М.: Медицина, 1984. -224 с.
3. Russel R.W., Overstreet D.H. Mechanisms underlying sensitivity to organohosphorus anticholinesterase compounds // Prog. Neurobiol. - 1987. -Vol. 28, N 2. -P. 97-129.
4. Teraki Y., Maemura S. Histotoxicity and minerali metabolism of chelating agent in rats // Eur. J. Pharmacol. -1990. - Vol. 183, N 6. -P. -2453.