УДК 619:616.981.49

Изучение антибиотикорезистентности микроорганизмов рода Lactobacillus выделяемых из желудочно-кишечного тракта кур и индеек

Афонюшкин В.Н. (lisocim@mail.ru)

ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, СО Россельхозакадемии

Шкред О.В. ООО ПФ «Сибирская Губерния» г.Красноярск.

Дударева Е.В., Филипенко М.Л. Институт химической биологии и фундаментальной медицины, СО РАН.

 

Общеизвестен факт негативного действия антибактериальных препаратов на нормофлору кишечника с/х птицы. В то же время можно с уверенностью утверждать о неоднородном действии различных антибактериальных препаратов на различные компоненты нормофлоры.

Данные о спектре антибиотикорезистентности лактобактерий желудочно-кишечного тракта сельско - хозяйственных птицы позволяют эмпирически подобрать антибиотики не повреждающие нормофлору. А технология определения антибиотикорезистентности условно-патогенной и нормальной микрофлоры уже используется в диагностической практике [3].

С другой стороны, лактобактерии являются доминирующим видом микробиоценоза желудочно-кишечного тракта [4], поэтому существует риск переноса генов антибиотикорезистентности различным представителям условно-патогенной микрофлоры.

Материалы и методы

Изоляцию латобактерий из кишечного содержимого осуществляли на среде MRS (Rogosa and Sharpe medium), с последующим субкультивированием на среде АПТ в анаэробных условиях. Количественное определение содержания латобактерий в кишечном содержимом производили методом серийных разведений навески кишечного содержимого слепых кишок и последующим высевом на среду MRS. Также использовали полуколичественную ПЦР основанную на методе конкурентного ингибирования с раститрованным внутренним контролем (набор производства фирмы «БиоКом»).

Принадлежность бактерий к роду Lactobacillus определяли по культуральным, морфологическим и биохимическим критериям [1].

Антибиотикорезистентность лактобактерий определяли диско-диффузионным методом на кровяном агаре с селективной добавкой фирмы  «Biolot» (г. Москва).

Антагонистическую активность лактобактерий в отношении золотистого стафилококка проводили на солевом бульоне с последующей оценкой ингибирующей активности лактобактерий путем высева стафилококка на среду Байрд Паркера.

Энтеробактерии выделяли на стандартных средах. Антибиотикорезистентность определяли диско-диффузионным методом и методом серийных разведений. Видовую принадлежность устанавливали с использованием биохимических тестов («ДС Нижний Новгород»).

Секвенирование проводили на приборе «Aplied biosistem  abi prism».

 

Результаты собственных исследований

В процессе исследований из кишечника кур было выделено и охарактеризовано в отношении антибиотикорезистентности 42 изолята относящихся к роду Lactobacillus.

В частности, было установлено, что на птицефабриках Сибирского и Уральского регионов у птицы преобладают лактобактерии устойчивые к тем или иным антибиотикам. Большая часть изолятов устойчива к нитрофуранам, гликопептидам и тетрациклинам (около 58%), устойчива к фторхинолонам (60-68%), и относительно редко встречаются изоляты устойчивые в отношении метронидазола, хлорамфеникола, лактамов, некоторых макролидов и линкозаминов.

В отличие от этих изолятов, культуры лактобактерий выделенные от кур не контактирующих с антибиотиками (Новосибирский зоопарк, частный сектор г. Новосибирска), либо из различных пробиотических продуктов (L. casei), как правило, были более чувствительны к перечисленным группам антибиотиков за исключением тетрациклинов и нитрофуранов. 

Таблица 1

Процент выделяемых изолятов лактобактерий с высоким и низким уровнем чувствительности к исследуемым антибиотикам

№ п/п	антибиотик	выборка	%(задержка  роста >20 мм.)	% (задержка роста отсутствует)
1	ампициллин	16	75	18.75
2	гентамицин	2	50	-
3	левомицетин	20	40	15
4	неомицин	10	40	10
5	норфлоксацин	5	20	60
6	оксациллин	21	9.523	61.904
7	офлоксацин	20	5	60
8	пенициллин	18	22.22	22.22
9	польодоксин	17	23.52	58.82
10	рифампицин	7	85.71	-
11	тетрациклин	18	16.66	66.66
12	тилозин	3	66.66	-
13	фуразолидон	21	14.28	66.66
14	цефазолин	2	100	-
15	энроколи	14	28.57	50
16	эритромицин	17	29.41	47.05
17	сульфаниламид	2	-	100
18	спектиномицин	11	-	63.63
19	энрофлоксацин	19	-	68.42

 

С целью изучения адекватности результатов полученных in vitro мы проанализировали ингибирующую активность антибиотика аминогликозидного ряда в отношении лактобактерий птиц содержащих устойчивый к терапевтическим концентрациям данного антибиотика изоляты NB 6 и SGP 10 (см. табл. 2).

 

 

Таблица 2 Сравнительная оценка антибиотикорезистентности лактобактерий диско-диффузионным методом, мм.

антибиотик	Зоны задержки роста изолятов
	NB6	SGP 10	SGD 1
пенициллин	24	14	20
сульфаниламид	-	-	-
неомицин	16	-	20
офлоксацин	18	-	24
энроколи	26	-	34
спектиномицин	-	-	26
польодоксин	-	-	-
энрофлоксацин	14	-	-
фуразолидон	-	-	8
ампициллин	32	-	26
оксациллин	8	-	-
левомицетин	20	-	32

 

После аэрозольной и пероральной обработки 2-х групп птицы данным антибиотиком, по истечении курса, у птицы 2-х опытных и одной контрольной групп были отобраны пробы кишечного содержимого. Методом количественной ПЦР было оценено содержание геномных эквивалентов лактобактерий в 1 гр. кишечного содержимого (Г.Э./1г.).

Введение антибиотика аминогликозидного ряда обусловило незначительное снижение содержания лактобактерий в кишечном содержимом с концентрации 2*10⁵   до 2*10^4.8 у птицы получавшей амингликозиды аэрозольно и до 2*10^4.2 геномных эквивалентов лактобактерий (ГЭ/1г).

С целью проверки эффективности диско-диффузионного метода для определения устойчивости лактобактерий к фуразолидону, методом серийных разведений установлена МИК для фуразолидона в отношении 8 выделенных изолятов лактобактерий которая составила 100мг/1л, таким образом эффективная концентрация фуразолидона должна превышать терапевтическую дозу в 100 раз. При этом почти все изучаемые изоляты характеризовались полным отсутствием зон задержки роста к фуразолидону при тестировании диско диффузионным методом.

 

Заключение: Полученные данные позволяют вывести эмпирическую закономерность – наиболее выраженным ингибирующим действием на лактофлору птиц могут обладать антибиотики бетта-лактамного ряда и группы хлорамфеникола, соответственно после их применения компенсаторная терапия дисбактериоза строго обязательна. Также следует рекомендовать использование с профилактическими целями нитрофуранов, антибиотиков тетрациклинового ряда ввиду низкого процента чувствительных изолятов рода Lactobacillus, с учетом антибиотикочувстивтельности условно-патогенной микрофлоры кишечника.

 Применительно к макролидам, фторхинолонам и аминогликозидам назначение пробиотиков или пребиотиков должно проводиться во взаимосвязи с  антибиотикочувстивтельности нормофлоры птицы на конкретной птицефабрике, с учетом возраста птицы, условий содержания и особенностей кормления.