УДК 636:576.8.07:006.354

Изучение возможности использования ПЦР для контроля качества вакцинации цыплят против болезни Марека.

Афонюшкин В.Н., Городов В.С., Юшков Ю.Г.

ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока,  СО РАСХН

Совокупность методических подходов, позволяющая прогнозировать развитие эпизоотии болезни Марека (БМ) в оптимально сжатые сроки, должна обеспечивать решение следующих задач: оценку качества вакцинации, выявление факторов способных выявить снижение эффективности вакцинации, выявление рисков заражения изучаемой популяции vv+ и vv++ штаммами ВБМ.

Данное исследование посвящено такому элементу контроля болезни Марека как оценка качества вакцинации против БМ.

Материалы и методы:

Цыплят для производственных и лабораторных испытаний использовали на птицефабриках Сибирского региона. Для вакцинации использовались вакцины фирмы «Интервет», ВНИИЗЖ.

Выделение геномной ДНК ВБМ проводили по методике предложенной нами ранее (Городов В.С., Афонюшкин В.Н., Юшков Ю.Г. 2005).

Для определения инфицированности органов и тканей вирусом болезни Марека проводили ПЦР на наличие гена А антигена, разработанную в нашей лаборатории.

В реакции использовали праймеры:

верхний: 5`-ATCGCGATGGAAGTTTTTGGT-3`

нижний: 5`-ATGCGGCTGAGGAGATTTC-3`

Реакцию проводили по следующей программе (см. табл. 1).

Табл.1 Температурные режимы ПЦР на ген А антигена ВБМ

этап	температура С	число циклов	время, мин
1	95	1	пауза
2	95	1	5
3	95	40	1
	63	40	1
	72	40	1
4	72	1	5

 

 

Результаты собственных исследований.

Для моделирования некачественной вакцинации был проведен следующий опыт - суточные цыплята (40 голов), были разделены на 4 группы (по 10 голов каждая) и вакцинированы против болезни Марека, 1; 0,01; 0,001 дозой вакцины соответственно, одна группа осталась невакцинированной. По истечении 10 дней, у цыплят был отобран материал (пробы печени), и тестирован методом ПЦР на наличие геномной ДНК вируса болезни Марека (см. табл.1).

 

Таблица 2.

Результаты исследования проб биоматериала в ПЦР от цыплят привитых различными дозами вакцины против болезни Марека «Rismavak».

 

№п/п	Группа 1	Группа 2	Группа 3	Группа 4
	1 доза	0,01 дозы	0,001 дозы	контроль
1	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО
2	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО
3	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО
4	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО
5	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО
6	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО
7	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО
8	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО
9	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО
10	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ПОЛОЖИТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО	ОТРИЦАТЕЛЬНО
Процент положит. реакций	100%	100%	40%	0%

 

 

Приведенные в таблице 2 данные свидетельствуют  о возможности использования ПЦР на геномную ДНК вируса болезни Марека для выявления случаев некачественной вакцинации или введения некачественной вакцины против болезни Марека.

Для отработки данной технологии в производственных условиях, были отобраны цыплята 8 - 10 дневного возраста из разных птицефабрик и корпусов с различной эпизоотической ситуацией вообще и по болезни Марека в частности (6 групп). Цыплята были подвергнуты диагностическому убою, из проб печени выделена ДНК и подвернута тестированию на наличие геномов ВБМ и микроорганизмов рода Salmonella с использованием предложенной нами мультиплексной ПЦР «ВБМ+САЛ-КОМ» (Афонюшкин В.Н., Юшков Ю.Г., Городов В.С., 2005). Дополнительно тестировали наличие CELO-инфекции путем индикации генома аденовируса 1-го серотипа с использованием разработанных нами праймеров а также микоплазмы  галлисептикум с помощью набора МИК-ГАЛ фирмы «Амплисенс» (Херрингтон С. 1987). Также проводили патогистологические исследования проб биоматериала от павшей птицы из исследуемых корпусов (Д.С.Саркисов, Ю.Л.Перова, 1996).

Анализ таблицы №3 показывает различный процент инфицированности цыплят ВБМ от 100 до 50%, между тем, все цыплята были привиты вакциной «бимарек» производства ВНИИЗЖ и теоретически, все группы должны были быть инфицированы вакцинным штаммом на 100%. Таким образом, мы можем считать целесообразным использование разработанной нами ПЦР с целью оценки качества вакцинации и выявления причин неполноценного инфицирования вакцинным штаммом.  Для дальнейшего анализа причин неполноценной вакцинации проанализировали качество вакцины подсчитывая количество живых клеток в камере Горяева – данная характеристика вакцины соответствовала норме. Особенностью эпизоотической ситуации в тестируемых группах птицы где уровень инфицированности ВБМ колебался от 60 до 50% являлось наличие инклюзионного гепатита (диагноз был подтвержден патогистологически). Как следует из наших исследований некоторые аденовирусы способны интерферировать с вакцинным штаммов ВБМ вытесняя его из органов и тканей птицы, что может привести к снижению противоэпизоотической эффективности вакцинации против БМ (Юшков Ю.Г., Афонюшкин В.Н., Полосухин В.Н. 2005).

Таблица №3 Процент положительных ПЦР реакций

группа	n	Сальмонелла	ВБМ	Микоплазма	CELO-инфекция
1	10	80	100	80	40
2	10	100	100	70	20
3	10	100	100	0	0
4	10	100	60	30	0
5	10	60	100	0	0
6	10	50	50	20	0

 

Оценка качества вакцинации и выявление факторов снижающих ее эффективность, по нашему мнению, должна базироваться в первую очередь на генодиагностике уровня инфицированности вакцинированного поголовья.

Как установлено многими исследователями именно своевременное заселение клеток и тканей птицы вакцинным штаммом обеспечивает эффективную иммунизацию (Амниев А.Г., Полехин С.В., Ломакин А.И, 1997).

Заключение: основываясь на проведенных исследованиях, мы рекомендуем тестировать эффективность вакцинации путем ПЦР исследования проб печени цыплят (не менее 10 особей) спустя 8-12 дней после вакцинации.

Литература.

1.     Амниев А.Г., Полехин С.В., Ломакин А.И, и др. Индикация и дифференциация вируса болезни Марека методами ПЦР и прямого секвенирования//Пробл. Инфекц. Патологии с.-х. ж-ных: Тез. Докл. Конф. –Владимир. -1997. – с. 159.

2.     Афонюшкин В.Н., Юшков Ю.Г., Городов В.С. Результаты использования компьютерного моделирования с целью разработки ПЦР-системы оптимальной для скрининговых технологий контроля болезни Марека//Журнал Вестник Сибирского отделения Российской сельско-хозяйственной академии. –С69-74 2005

3.     Юшков Ю.Г., Афонюшкин В.Н., Полосухин В.Н, Городов В.С., Леонов С.В. Использование поляризационной микроскопии витальных препаратов седалищного нерва для контроля вакцинации против болезни Марека./Архив ветеринарных наук т.6 (53), часть 1, 2005 г. –С. 17-21

4.     Под.ред. Д.С.Саркисова, Ю.Л.Перова, Микроскопическая техника: руководство/ -М.: Мед.,1996 с.187-189

5.     Херрингтон С. Молекулярная клиническая диагностика. Методы./ Под ред.С.Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир. 1988 с. 120-122