Особенности развития резистентности микроорганизмов рода Salmonella к антибиотикам энрофлоксацинового ряда

 

Афонюшкин В.Н., Дударева Е.К., Малахеева Л.И., Филиппенко М.Л. Степнов В.А. , Шкред О.В.

ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемия, ИХБФМ СО РАН, КРКА

lisocim@mail.ru

 

Интенсификация промышленного птицеводства, повышение санитарной культуры, массовое использование антимикробных средств в лечебно-профилактических целях практически вывело сальмонеллез за рамки экономической проблемы. Тем не менее, среди токсикоинфекций, регистрируемых у людей, это заболевание по-прежнему занимает лидирующее положение. Не секрет, что, преследуя цель получения продукции высокого санитарного качества, многие ветеринарные специалисты тщательно скрывают факт наличия сальмонелл в условиях своего производства.  Однако, почти  на каждой птицефабрике имеется птица, инфицированная сальмонеллой, с той лишь разницей, что в некоторых хозяйствах уровень инфицированности настолько низок, что не позволяет проявляться клиническим формам заболевания, а, следовательно, и приводить к большим экономическим потерям. Но, риск обнаружения санитарными службами сальмонелл в продуктах птицеводства, существует всегда.

В целях изучения уровня инфицированности стад данной группой микроорганизмов и особенностей формирования резистентности их к широко используемым в птицеводстве антибактериальным средствам мы провели исследование патматериала, отобранного в ряде птицеводческих хозяйств Сибирского региона, преимущественно мясного направления.

Материалы и методы  Сальмонелл выделяли на стандартных средах, с использованием селенитового бульона, висмут-сульфит агара. Антибиотикорезистентность определяли диско-диффузионным методом и методом серийных разведений. Видовую принадлежность устанавливали с использованием биохимических тестов ПБДЭ («ДС Нижний Новгород») и иммунохимически, полученные данные верифицировали методом ПЦР.

Для индикации сальмонелл методом ПЦР отбирали пробы из внутренних органов, делали клоакальные смывы. ДНК выделяли с использованием набора «ДНК-сорб Б» («Интерлабсервис») и с помощью метода разработанного нами. Для постановки ПЦР использовали тест-систему «Сал-ком» («Интерлабсервис»). Также в исследованиях использовалась количественная  Real-time PCR c зондом Такман разработанная в ИХБФМ СО РАН.

Результаты собственных исследований и обсуждение.

При исследовании тканей и внутренних органов птицы родительского и промышленного стад на момент убоя методом ПЦР мы установили большой процент инфицированности их различными видами сальмонелл (табл. 1). Это еще раз доказывает факт высокой устойчивости данной группы микроорганизмов к фагоцитозу, что во многом обеспечивает длительное бактерионосительство, особенно в отношении птицы родительского стада. 

Таблица 1.

Инфицированность органов и тканей кур мясного направления,

неблагополучных по сальмонеллезу стад, микроорганизмами

рода сальмонелла, по результатам ПЦР

 

Исследуемые органы	Родители		Бройлеры
	n, кол-во проб	Процент положит. проб	n, кол-во проб	Процент положит. проб
Сердце	8	25%	11	54,5%
Печень	10	10%	16	6,2%
Почки	10	10%	9	0%
Легкое	8	0%	11	27%
Селезенка	8	0%	20	20%
Костный мозг	8	25%	9	55,5%
жкт		-	34	11,76%
кровь	15	13,3%	6	16,6%

 

Незначительная индикация сальмонелл в ЖКТ еще не означает, что данные бактерии не выделяются с пометом. Состояние латентной инфекции динамично и с изменением внешних и внутренних условий (стрессы, действие иммунодепрессивных вирусов, микотоксикозы и т.д.) довольно быстро может перейти в острую форму, сопровождающуюся септицемией и активным выделением сальмонелл в окружающую среду. Обращает на себя внимание высокий процент встречаемости ДНК сальмонелл в костном мозге, крови и сердце, в первую очередь у молодой птицы. Это может быть обусловлено незрелостью различных систем иммунитета и доказывает хроническое течение процесса, которое характеризуется развитием дегенеративных процессов во внутренних органах, особенно выраженных в сердце и печени. Со временем возможна генерализация процесса, сопровождающая развитием септицемии и токсемии, что, очевидно, регистрировалось бы при проведении ПЦР большим содержанием ДНК сальмонеллы в крови. Учитывая, что птица, от которой отбирался патматериал на исследование, подвергалась стандартным лечебно-профилактическим обработкам, можно предположить, что не все используемые для этой цели антимикробные средства создают необходимую для элиминации сальмонелл концентрацию в сердце и костном мозге. Высокая инфицированность костного мозга  создает большую опасность и для потребителя птицеводческой продукции, поскольку в процессе переработки очень сложно добиться требуемой для уничтожения сальмонелл температуры внутри кости. Обнаружение ДНК сальмонелл в легочной ткани у бройлеров в 27% случаях может являться следствием аэрогенного заражения и привести к развитию серозно-фибринозной пневмонии.

Другой путь заражения – алиментарный, часто считается основным. Учитывая это, желудочно-кишечный тракт можно рассматривать как входные ворота и место резервации сальмонеллезной инфекции, а также как один из важных органов, откуда происходит диссеминация возбудителя. Поэтому мы сочли целесообразным для ПЦР-скрининга и мониторинга сальмонеллоносительства на птицефабриках, использовать клоакальные смывы. Отбор проб производили одноразовыми стерильными тампонами, метод отбора позволял проводить прижизненную диагностику и сводил риск перекрестной контаминации к минимуму (табл.2).

Таблица 2.

Скрининг четырех птицефабрик Сибирского региона на носительство сальмонелл по результатам ПЦР.

тип стада	возраст птицы	выборка	материал	процент положительных проб
Бройлеры	15дн	6 проб	клоака	33,3%
Бройлеры	21дн	5+5 проб 2 разных корпуса	клоака	50%
Родительское стадо	170дн	8 проб	клоака	0%
несушка	195дн	10 проб	клоака	0%

 

Как следует из таблицы №2, уровень инфицированности стад варьировал от 0 до 50%. Надо отметить тот момент, что отсутствие ДНК сальмонелл в клоакальных смывах у птицы родительского стада и несушек еще не означает отсутствие инфекционного процесса. Это может быть связано с развитием нормофлоры в кишечнике у взрослой птицы и достаточным уровнем лактобактерий, антагонистическая активность которых  в отношении сальмонелл, была неоднократно доказана в различных исследованиях. Но данный факт не исключает наличие латентной формы инфекции, которая характерна для взрослой птицы и сопровождается локализацией возбудителя в репродуктивной системе.

 Интересно, что с возрастом инфицированность бройлерных стад возрастает почти в два раза. Можно предположить, что без принятия каких-либо мер, в частности проведения антимикробной терапии, она вполне может достигнуть к забою и 100%.

Для оценки эффективности лечебно-профилактических мероприятий, проводимых в хозяйствах  и направленных на снижение инфицированности стад патогенными микроорганизмами рода Salmonellа нами была определена антибиотикорезистентность выделенных штаммов к антимикробным средствам, используемым на производствах (табл. 3). Как известно антибиотики группы макролидов, линкосамидов и рифамицинов (тилозин, клиндамицин и т.д.) имеют узкий спектр действия, направленный преимущественно на грамположительные бактерии, что и подтверждается отсутствием чувствительных к ним изолятов сальмонелл.

Таблица 3.

Антибиотикочувствительность выделяемых культур сальмонелл

Антибиотик	Процент чувствительных изолятов
Амоксициллин	83,3%
Амоксиклав	83,3%
Клиндамицин	0%
Рифампицин	0%
Энрофлоксацин	66,6%
Левомицетин	66,6%
Гентамицин	16,6%
Тилозин	0%
Спектиномицин	83,3%
Флубактин	83,3%
Оксацилин	0%
Ампициллин	80%
цефазолин	60%
сульфаниламид	60%

 

Снижение чувствительности сальмонелл к фторхинолонам свидетельствует о широком применении данной группы антимикробных средств в птицеводстве, следствием чего стало появление устойчивых штаммов микроорганизмов. При этом следует отметить, что Флубактин® (ДВ - флумеквин) производства компании «КРКА», Словения, хотя и относящийся к группе фторхинолонов,  показал высокую эффективность в отношении выделенных штаммов сальмонелл.

Конечно, нельзя гарантировать 100%-ную адекватность результатов лабораторных исследований. Потому как в реальной практике антибиотик работает в окружении значительно большего числа видов микроорганизмов, чем было выделено в процессе микробиологических исследований. В лабораторных условиях практически невозможно воспроизвести реакцию организма курицы на возбудителя инфекционного заболевания.

Поэтому было принято решение провести дополнительные исследования для установления эффективности Флубактина® в отношении сальмонеллезной инфекции в условиях реального производства. С этой целью бройлерам в возрасте 21 суток выпаивали Флубактин® 20%-ный оральный раствор в дозе 500 мл на тонну питьевой воды в течение 5 суток. До и после курса антибиотикотерапии была проведена ПЦР диагностика клоакальных смывов на наличие ДНК сальмонелл (результаты представлены в таблице 4).

Таблица 4.

Уровень инфицированности бройлерных стад сальмонеллами до и после обработки Флубактином® 20%-ным оральным раствором

тип стада	возраст птицы	выборка	материал	процент положительных проб
Бройлеры до обработки Флубактином®	21дн	5+5 проб 2 разных корпуса	клоака	50%
Бройлеры после обработки Флубактином®	28 дн	4+4 проб 2 разных корпуса	клоака	0%

 

         Исходя из вышеизложенных в таблице данных, можно сделать вывод, что применение Флубактина® 20%-ного орального раствора в отношении лечения и профилактики птицы против сальмонеллеза является высокоэффективным, а небольшой период карренции позволяет использовать данный препарат и на поздних сроках выращивания бройлеров. 

Полученные результаты позволяют предположить, что развитие резистентности у микроорганизмов рода сальмонелл к антибиотикам даже относящимся к одной группе вариабельно и может иметь некоторые особенности, что обуславливает их разную восприимчивость к представителям одного класса антимикробных средств.

Заключение: результаты наших исследований свидетельствуют о высоком уровне сальмонелленосительства в бройлерных стадах с преимущественной локализацией сальмонелл в сердце и костном мозге.  В системе профилактики сальмонеллоносительства у сельскохозяйственной птицы важным элементом является контроль эффективности схем антибиотикопрофилактики, учитывающий весь комплекс факторов влияющих на эффективность действия антибиотика в организме. Высокоэффективное средство для лечения и профилактики сальмонеллеза у бройлеров - Флубактин® 20%-ный оральный раствор, даже в условиях наличие некоторой устойчивости сальмонелл к фторхинолонам, в частности энрофлоксацину.

 

Литература

1.     Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж. Хоулта. М. : «Мир». 1997

2.     Jensen, M. A., J. A. Webster, and N. Straus. 1993. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms. Appl. Environ. Microbiol. 59:945-952