Санация систем водоснабжения в промышленном животноводстве

Афонюшкин В.Н., ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока, СО Россельхозакадемии, Шкред О.В. ООО ПФ «Сибирская Губерния» г.Красноярск., Дударева Е.В., Филипенко М.Л. Институт химической биологии и фундаментальной медицины, СО РАН.

Татарчук О.П., представительство компании «КРКА» (Словения) в РФ

 

Как во внешней среде, так и в организме животных микроорганизмы особым образом сгруппированы в биопленки — специфически организованные экосистемы, в которых микроколонии бактерии погружены в слой защитного биополимерного матрикса вместе с другими микроорганизмами.

В последние годы стало известно, что именно биопленка является предпочтительное формой существования бактерий: 99% всех микроорганизмов на планете обитает в подобных консорциумах, а не поодиночке. Такое «социальное поведение» микроорганизмов обеспечивает им защиту и позволяет выжить в неблагоприятных условиях, например при минимуме питательных веществ или в присутствии антимикробных средств (Lewis, 2001).

Клиническое значение имеет высокая устойчивость бактерий в таких сообществах: биопленки в 20-1000 раз более устойчивы к антимикробным препаратам, чем микроорганизмы в культуральной среде (Brown et al., 1993), поэтому эффективность большинства режимов санации и дезинфекции в реальных условиях зачастую оказывается недостаточной.

 Основным фактором устойчивости микробных пленок является слизистый биополимерный матрикс (БПМ), вырабатываемый клетками бактерий сразу после прикрепления к субстрату. БПМ различных биопленок непостоянен по составу, который меняется в результате адаптации бактерий к условиям внешней среды, но в общем случае включает экзополисахариды, липополисахариды, гликопротеины и протеогликаны, аналогичные веществу клеточной стенки, гликокаликса и капсул бактерий (Gander, 1996). Эти биополимеры в микробной пленке действуют как молекулярное сито, улавливая и концентрируя питательные вещества из окружающей среды, а также ограничивая проникновение антимикробных средств к бактериям в глубине биопленки.

Классическим примером защитных функций биополимеров является выживание Salmonella в биопленке при хлорировании: БПМ ограничивает диффузию хлора через поверхность биопленки вглубь, обеспечивая устойчивость микробной пленки к этому способу дезинфекции (Ronner et al., 1993). Гипохлорит-ионы также снижают свою активность за счет инактивации биополимерами в поверхностных слоях бактериальной пленки.

Аналогичное защитное действие БПМ биопленок проявляется в отношении катионных детергентов — соединений, входящих в состав многих моющих, дезинфицирующих и антисептических препаратов. Так, средства на основе четвертичных аммонийных соединений (ЧАС) оказались неэффективны против биопленок E. coli, Pseudomonas, Listeria и S. aureus даже в повышенных концентрациях: отрицательно заряженные полисахариды БПМ способны связывать положительно заряженные молекулы ЧАС и тем самым защищать биопленку от уничтожения (Campanac et al., 2002). Этот же механизм является причиной устойчивости микробных пленок к бигуанидам (Wright et al., 1987) и дезсредствам на основе фенольных соединений (Gilbert et al., 1978). Присутствие в воде минеральных солей (особенно фосфатов и сульфатов) значительно повышает электроотрицательность БПМ и тем самым снижает эффективность антимикробных обработок, а двухвалентные катионы кальция и магния увеличивают вязкость и эластичность биополимерного геля микробных пленок, что затрудняет процесс очистки поверхностей (Sutherland, 1990).

Широко применяемые дезинфектанты на основе формальдегида, глутаральдегида и ортофталальдегида также оказались неэффективны против микробных пленок (Gomes De Saravia et al., 2003).

Мы провели сравнительное исследование эффективности Экоцида С (производства фирмы «KRKA», Словения) и формальдегида в отношении микроорганизмов, сконцентрированных в биопленках системы водоснабжения обычной птицефабрики. Для визуального определения жизнеспособности бактерий после воздействия биоцидов была использована люминисцентная микроскопия биопленок, окрашенных диацетатом флуоресцеина.

Оказалось, что Экоцид С успешно ликвидировал все микроорганизмы в составе бактериальных биопленок. В то же время формальдегид даже в концентрации 0,25% был неэффективен, что подтверждает данные других исследователей о низкой эффективности альдегидных соединений в отношении микробных пленок. Ранее было обнаружено, что глутаральдегид реагирует с аминогруппами БПМ, поперечно сшивая длинные молекулы биополимеров, чем вызывает лишь набухание или коагуляцию поверхностного слоя биопленки, делая невозможным дальнейшую диффузию глутаральдегида вглубь микробной пленки (Simons et al., 2000).

Помимо ограниченной диффузии, существует другой механизм устойчивости бактерий в биопленках — каталитическое расщепление с помощью ферментов. Известно множество ферментов, которые выделяются бактериями в окружающую среду для предохранения от действия разных классов антимикробных средств (Stewart et al., 1995). Например, каталаза и пероксидаза вырабатываются бактериями для защиты от губительного действия перекиси водорода, которая способна быстро уничтожить микроорганизмы в суспензии. Однако перекись водорода неэффективна против уже сформированной микробной пленки: биополимеры адсорбируют большие количества выделяемой каталазы, и перекись водорода не успевает проникнуть вглубь биопленки, разлагаясь на поверхности микробной пленки без вреда для микроорганизмов (табл. 1).

 

Таблица 1

Устойчивость Pseudomonas aeruginosa к перекиси водорода в биопленке и в суспензии

 

Снижение количества бактерий:	Время обработки
	20 минут	60 минут
в биопленке, log	0,31	0,26
в суспензии, log	—	4,6

 

Как видно из таблицы, перекись водорода обеспечила значительное (4,6 log) снижение числа бактерий в суспензии, но оказалась неэффективна против бактерий в биопленке. Как было выяснено, глубина проникновения перекиси водорода составила менее 17 микрометров — это всего лишь 1/10 толщины исследованной микробной пленки.

Более того, в ответ на стрессовое воздействие выделяющегося кислорода бактерии продемонстрировали характерный для всех биопленок механизм: микроорганизмы поверхностных слоев «просигнализировали» глубже лежащим бактериям о необходимости выйти из фазы покоя и приступить к размножению. Такая коллективная адаптация бактерий ускорила синтез дополнительных количеств каталазы для защиты экосистемы микробной пленки от воздействия биоцида. Несмотря на обильное выделение газообразного кислорода в виде пузырьков, перекись водорода не проникла вглубь биопленки даже спустя почти час после начала обработки, (Stewart et al., 2000).

В отличие от упомянутых средств для мойки и дезинфекции, окислительная активность Экоцида С не зависит от защитных ферментных систем микробной пленки. Более того, в ответ на действие пероксидазы Экоцид С способен формировать ряд супероксид-ионов, губительно действующих на бактерии. Аналогичный механизм действия используют макрофаги против фагоцитированных ими бактерий (Klebanoff, 1968). Наличие анионного детергента в составе Экоцида С позволяет беспрепятственно проникать на всю толщину биопленок и окислять биополимеры независимо от степени минерализации воды.

Таким образом, уникальный механизм действия Экоцида С обеспечивает высокую эффективность против бактериальной биопленки в системах водоснабжения, особенно в случае высокой минерализации и органического загрязнения.

Литература

 

1.      Brown M.R.W., Gilbert P. 1993. Sensitivity of biofilms to antimicrobial agents. J. Appl. Microbiol. S47: 87-97.

2.      Campanac C., Pineau L., Payard A., Baziard-Moysset G., Roques C. 2002. Interaction between  biocide cationic agents and bacterial biofilm. Antimicrob. Agents Chemother. 46: 1469-1474.

3.      Gander S. 1996. Bacterial biofilms: resistance to antimicrobial agents. J. Antimicrob. Chemother. 37: 1047-1050.

4.      Gilbert P., Brown M.R.W. 1978. Influence of growth rate and nutrient limitation on the gross cellular composition of Pseudomonas aeruginosa and its resistance to 3- and 4-chlorophenol. J. Bacteriol. 133: 1066-1072.

5.      Gomes De Saravia S.G., Fernandes Lorenzo De Mele. 2003. Non-invasive methods for monitoring biofilm growth on industrial water systems. Latin Am. Appl. Res. 33: 353-359.

6.      Klebanoff S.J. 1968. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J. Bacteriol. 95: 2131-2138.

7.      Lewis K. 2001. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 45: 999-1007.

8.      Ronner A.B., Wong A.C.L. 1993. Biofilm development and sanitizer inactivation of Listeria monocytogenes and Salmonella Typhimurium on stainless steel and Buna-n rubber. Journal of Food Protection. 56: 750-758.

9.      Simons C., Walsh S.E., Maillard J.-Y., Russel A.D. A note: Orth-Phthalaldehyde: proposed mechanism of action of a new antimicrobial agent. Lett. Appl. Microbiol. 31: 299-302.

10.  Stewart P.S., Raquepas J.B. 1995. Implication of reaction-diffusion theory for the disinfection of microbial biofilms by reactive antimicrobial agents. Chem. Eng. Sci. 50: 3099-3104.

11.  Stewart P.S., Roe F., Rayner J., Elkins J.G., Lewandowski Z., Ochsner U.A., Hasset D.J. 2000. Effect of catalase on hydrogen peroxide penetration into Pseudomonas aeruginosa biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 66: 836-838.

12.  Sutherland I.W. 1990. Biotechnology of exopolysaccharides. Cambridge University Press.

13.  Wright N.E., Gilbert P.1987. Influence of specific growth rate and nutrient limitation upon the sensitivity of E. coli towards chlorhexidine diacetate. J. Appl. Bacteriol. 62: 309-314.