РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ

СИБИРИ И ДАЛЬНЕГО ВОСТОКА

 

 

 

 

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЦР В СИСТЕМЕ КОНТРОЛЯ ПСЕВДОМОНОЗА И ПАСТЕРЕЛЛЕЗА СЕЛЬСКО-ХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ

 

 

 

 

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Новосибирск - 2007 г.

 

 

 

УДК: 636.619

Использование пцр в системе контроля псевдомоноза и пастереллеза с.-х. птицы / Россельхозакадемия. Сибирское отделение. ГНУ ИЭВСиДВ, -Новосибирск, 2007. - 22 с.

Сходство поражений при сепсисе у птиц и с.-х. животных создает сложности при установлении диагноза, кроме того, эти инфекционные агенты способны вызывать бессимптомное носительство, часто не выявляемое традиционными методами. Поэтому, разработка мультиплексной ПЦР позволит решить проблему выявления этих инфекционных агентов, как с целью постановки диагноза, так и для выявления животных носителей.

            В данных методических рекомендациях описаны теория и практика метода контроля стад кур на наличие геномной ДНК микроорганизмов рода пастерелла и синегнойной палочки, даны описание методов пробоподготовки, вопросы интерпретации информации, интеграции тестов в систему эпизоотологической диагностики.

Данные рекомендации рассчитаны на сотрудников НИУ и специалистов по лабораторной диагностике.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Методические рекомендации подготовили: доктор вет. наук Н.А. Шкиль,  канд. вет. наук Ю.Г. Юшков, канд. вет. наук В.Ю. Коптев, канд. биол. наук В.Н. Афонюшкин, В.С. Городов, С.В. Леонов (ГНУ ИЭВСиДВ)

Рекомендации рассмотрены и утверждены Ученым советом ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (протокол №  от                  2007 г. ) и подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №  от      2007 г.).

Работа выполнена при поддержке администрации Новосибирской области.

 

 

 

Рецензент: д-р вет. наук Димов С.К.

 

 

 

 

 

 

 

Содержание:                                                                                            стр.

Введение	2
1.     Клинические, патологоанатомические и эпизоотологические критерии дифференциальной диагностики пастереллезов и псевдомонозов	4
2. Техника проведения молекулярно-биологических методов исследований	13
2.1  Принципы отбора проб	13
2.2 Пробоподготовка	14
2.3 Постановка ПЦР, рестрикция и электрофорез	17
3. Вопросы интерпретации информации и методы обработки результатов	19
4.     Заключение	21
5.     Литература	22

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение

Проблемы индикации актуальных для ветеринарии возбудителей бактериальных инфекций стоят достаточно остро. Существует потребность в массовом, высокочувствительном и специфичном методе. ПЦР для выявления отдельных возбудителей бактериозов в патологическом материале недостаточно эффективна ввиду узкой специфичности. В то же время классические бактериологические исследования имеют такие недостатки как: длительность исследований, наличие некультивируемых форм бактерий, сложность выделения культуры из организма обработанного антибиотиками.

В настоящее время на некоторых птицеводческих и животноводческих предприятиях НСО нами и нашими коллегами регулярно регистрирует пастереллез. По нашему мнению, на птицефабриках Сибирского региона сформировались условия для увеличения частоты встречаемости данного заболевания вызываемого микроорганизмами рода Pasterella. К таковым факторам мы относим увеличившуюся частоту вспышек болезни Ньюкасла и TRT вызываемых пневмо- и лимфотропными вирусами. Как известно, эти вирусные инфекции значительно повышают восприимчивость птицы как бактериальным инфекциям поражающим респираторную систему[4].

Патологии вызываемые микроорганизмами P. aerugenosa (синоним синегнойная палочка) обычно носят менее массовый характер, но ввиду хорошей приживаемости в окружающей среде, избежать заражения птицы, сельско-хозяйственных животных и человека очень сложно [6]. Будучи чрезвычайно устойчивой к антибиотикам, синегнойная палочка составляет серьезную проблему при лечении раневых и хирургических инфекций у человека а также наносит определенный экономический ущерб птицеводству вызывая гибель эмбрионов и поражая респираторную систему птицы (псевдомоноз).

         Сходство поражений при сепсисе у птиц и сельско-хозяйственных животных создает сложности при установлении диагноза, кроме того, эти инфекционные агенты способны вызывать бессимптомное носительство, часто не выявляемое традиционными методами. Поэтому, разработка мультиплексной ПЦР позволит решить проблему выявления этих инфекционных агентов, как с целью постановки диагноза, так и для выявления животных носителей.

 

1. Клинические, патологоанатомические и эпизоотологические критерии дифференциальной диагностики пастереллезов и псевдомонозов.

 

Пастереллез и псевдомоноз сельско-хозяйственной птицы обычно сопровождается инфицированием одних и тех же органов и тканей таких как: легкие, сердце, паренхиматозные органы [2,7], поэтому использование мультиплексной ПЦР будет вполне уместно для дифференциальной диагностики, в то же время биологические особенности пастерелл и псевдомонасов не создают существенных предпосылок для развития ассоциированных инфекций. В этой связи, риск конкурентного ингибирования одной из реакций – минимален.

Пастереллез, в острой форме характеризуется массовостью поражения, скоротечностью заболевания и высокой летальностью. К специфичным изменениям при пастереллезе относят патологоанатомические признаки характерные для картины острого бактериального сепсиса вообще. В частности это кровоизлияния на сердце (петехии и экхимозы), несвернувшаяся кровь, острый нефрит, кровоизлияния в других паренхиматозных органах и геморрагическое воспаление в иммунокомпетентных органах и тканях в частности селезенке, переходной зоне между железистым и мышечным желудком, лимфоидных образованиях в области бифуркации  слепых кишок. При молниеносной форме эти изменения сглажены, например селезенка почти не увеличена, либо напротив, уменьшена. При острой форме картина наиболее яркая, в то время как при подострой и хронической формах течения заболевания патологоанатомические признаки в значительной степени варьируют сопровождаясь повышенной частотой проявления омфалитов, артритов, миокардиосклерозов, гнойно-фибринозных пневмоний и т.д.

Соответственно, аналогичные патологоанатомические изменения могут встречаться при псевдомонозе, актинобациллезе, орнитобактериозе, колибактериозе, болезни Ньюкасла, клебсиеллезе, стептококковой септицемии, гемофиллезе и орнитозе.

      В этой связи очень быстрым и удобным тестом для исключения пастереллезов является метод бактериоскопии мазков отпечатков окрашенных метиленовым синим по Леффлеру. При пастереллезах можно увидеть характерные биполярно окрашенные палочки, иногда очень короткие бобовидной формы палочки. Следует отметить что аналогичной морфологией могут обладать актинобациллюсы, орнитобактерии и, иногда пастереллы можно спутать со споровыми формами бацилл. Кроме того, наиболее чувствительные к пастереллезу особи, например, индейки, могут погибать от токсического шока при заражении чрезвычайно низкой инфекционной дозой пастерелл, поэтому необходимо происследовать достаточное количество мазков. Не очень чувствителен метод мазков отпечатков при хронических формах пастереллезов. В любом случае результаты таких исследований должны уточняться более специфичными методами.

Достаточно характерным явлением для пастереллеза является повышенная чувствительность взрослой птицы к инфицированию пастереллами. Это не означает что молодняк не заражается и не болеет пастереллезом, более того, по нашим наблюдениям у молодой птицы выше концентрация пастерелл, чаще наблюдаются латентные формы заболевания, и, по видимому, перезаражение стада происходит преимущественно в молодом возрасте а половое созревание провоцирует массовое проявление острой формы инфекции. Повышенная чувствительность к пастереллезной инфекции взрослой птицы позволяет дифференцировать это заболевание от псевдомоноза, и от моноинфекции колибактериоза. В данной ситуации косвенным и не очень достоверным диагностическим критерием отличающим пастереллез от орнитобактериоза и актинобациллеза может являться массовость заболевания и высокая летальность.

Псевдомоноз в виде моноинфекции проявлется преимущественно у молодняка кур и индеек сопровождаясь пневмониями, аэросаккулитами и сепсисом, фибринозными перигепатитами, нефритами, миокардитами и т.д.. В септической форме он способен проявляться и у бройлеров старше 20 дневного возраста, при этом картина патологоанатомических изменений практически неотличима от колибактериоза.

Также широко распространена гибель эмбрионов во второй половине инкубации.

К другой форме псевдомоноза, мы относим кормовую токсикоинфекцию. При повышенной влажности кормов мы обнаруживали высокие концентрации синегнойной палочки (СГП), более 1 млн кое/гр. Ввиду того, что синегнойная палочка способна накапливаться в окружающей среде, то при высоких ее концентрациях возможно заболевание бройлеров предубойного возраста. Как правило, мы отмечали наличие ассоциированной формы инфекции  E. coli и СГП.  Характерной особенностью при этом было поражение воспаление прямой и двенадцатиперстной кишки, катаральной воспаление железистого желудка, у молодняка желудок приобретал темную окраску, гепатит, холецистит. При скармливании кормов с повышенной обсемененностью СГП лабораторным животным отмечалось уменьшение содержания лактобактерий в желудочно-кишечном тракте в несколько десятков раз, и воспроизводились аналогичные поражения желудочно-кишечного тракта.

Бактериологическая диагностика псевдомоноза была затруднена ассоциированным заражением кишечной палочкой, которая высевалась в большем количестве чем СГП. В данной ситуации обязательно использование селективной среды для выделения P. aerugenosa с цетримидом.

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 1 Дифференциальная диагностика пастереллеза и псевдомоноза в острой форме

Диагностический признак	СГП	Пастерелла	ОРТ	НБ	E.coli
1	2	3	4	5	6
Кровоизлияния на сердце	Слабые, сочетаются с фибринозным перикардитом	Петехии и экхимозы	Точечные кровоизлияния	В сочетании повсеместными кровоизлияниями в различных органах	При острой форме возможны, но часто будут встречаться и фибринозные перикардиты
Массовая гибель	Редко	Часто	Редко, перимущественно у индеек	Часто	Либо в молодом возрасте, либо в ассоциации с некоторыми вирусными инфекциями
Возраст преимущественного проявления клинических признаков	До 15 суток	Старше 50 дней у индейки и к началу яйцекладки у кур несушек	Старше 50 дней у индейки и к началу яйцекладки у кур несушек	В широком диапазоне возрастов, обычно на фоне срыва поствакцинального иммунитета	До 20 дней в виде моноинфекции, старше 20 дней как ассоциированная либо финальная инфекции
Гастродуоденит	да	да	да	Поражения преимущественно переходной зоны на фоне системной полиорганной недостаточности	Редко, являясь факультативным анаэробом E.coli способно поражать ЖКТ на всем протяжении
Резкое увеличение селезенки	да	да	да	При осложнении бактериальными инфекциями	да
Реакция на специфическую вакцинопрофилактику	Вакцина не применяется	Снижается распространенность острой формы но остаются хронические и латентные формы инфекции	Вакцина не применяется	выраженный протективный эффект	Иногда парадоксальная реакция – резкое увеличение падежа от коли-инфекции
1	2	3	4	5	6
Ассоциируемость с пневмовирусами (НБ, АRТ, PV 1-2)	Не описана	Может иметь место	Практически всегда		НБ снижает чувствительность респрираторной системы к инфицированию E.coli в 40 раз
Диагностическая значимость ПЦР анализа	Наличие ДНК в сердце имеет диагностическое значение, в легких и ВДП встречается довольно часто	Имеет значение при обнаружении в любом органе и ткани	Имеет значение при сопоставлении инфицирования и наблюдаемой патологии	Ввиду широкой распространенности вакцинных штаммов, диагностического значения не имеет	В виду широкой распространенности в кишечнике, имеет значение детекция генов патогенности как составной элемент бактериологического анализа

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 2. Дифференциальная диагностика пастереллеза и псевдомоноза при хроническом и латентном течении

Диагностический признак	СГП	Пастерелла	ОРТ	МС	Сальмонелла	E.coli
1	2	3	4	5	6	7
Кровоизлияния на сердце	редко	Периодически встречаются на вскрытии	редко	нет	нет	Не видны ввиду фибринозных отложений в перикарде
Поражения органов репродуктивной системы	нет	Оварииты, овариосальпингиты	Редко оварииты, овариосальпингиты	нет	Часто, оварииты и овариосальпингиты	Редко, обычно на фоне системных поражений
Желточные перитониты у несушки	нет	редко	нет	нет	часто	Нет
Снижение яйцепродукции
Гнойно-фибринозные пневмонии	да	да	да	нет	редко	да
Аэросаккулиты	Значительные отложения фибрина	Помутнение воздухоносных мешков	Значительные отложения фибрина	Помутнение воздухоносных мешков, иногда отложения фибрина, но в незначительном, по сравнению с воспалением суставов
1	2	3	4	5	6	7
Синдром «сырной курицы»	да	да	да	нет	нет	да
Ассоциируемость с пневмовирусами (НБ, АRТ, PV 1-2)	нет	да	да	нет	нет	да
Поражения опорно-двигательного аппарата	редко	Поражение тазобедренных суставов, некроз головки бедренной кости, особенно на фоне вакцинации, у бройлеров. Хромота, горячие скакательные суставы.	редко	Подострый артрит, отложение амилоида в суставных полостях и сухожильных влагалищах.	Гнойное, нередко ассиметричное воспаление суставов	редко
Диагностическая значимость ПЦР анализа	низкая	высокая	высокая	высокая	высокая	низкая
Поражение печени	Гепатит, холецистит, либо фибринозный перигепатит	Острый гепатит. Очаговые некрозы	Острый гепатит	нет	Острый гепатит, нередко с мелкими очаговыми некрозами, скопления нейтрофилов в очаге поражения	Фибринозный гепатит.
Возраст	Преимущественно молодняк	В широком диапазоне возрастов но распространенность растет по мере увеличения возраста	В широком диапазоне возрастов но распространенность растет по мере увеличения возраста	Старше 15-20 дней	Преимущественно до 20 дней, либо после полового созревания	В течение всего периода выращивания

 

1	2	3	4	5	6	7
ЖКТ	Гастродуоденит, проктит	Дуоденит	Дуоденит	нет	Энтероколит, белый понос (ввиду нарушения переваривания жиров)	Энтерит, энтероколит.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Техника проведения молекулярно-биологических методов исследований

2.1 Принципы отбора проб

Тактика мероприятий по отбору проб на ПЦР заключается в исключении контаминации пробы, инструментов и посуды посторонними нуклеиновыми кислотами. Трудность заключается в том, что инактивированные микроорганизмы остаются источниками нуклеиновых кислот, поэтому обработка, например рук, инструментов спиртом не предотвратит контаминации проб посторонней ДНК.

Один из основных принципов предотвращения контаминации - аккуратность. Необходимо следить за тем, чтобы инструменты, руки и прочие поверхности соприкасающиеся с биоматериалом, пробой не контактировали с другой пробой либо чистыми посудой, инструментами, руками.

Другой принцип - использование одноразовой, пластиковой посуды, контейнеров и перчаток.

Третий принцип - разрушение нуклеиновых кислот на поверхностях инструментов, мебели. Инструменты, перед отбором очередной пробы необходимо  очищать и обжигать над пламенем спиртовки. Помещение пред началом работы желательно обрабатывать ультрафиолетовым излучением в течение часа. После работы помещение, мебель и инструменты желательно очистить от остатков биоматериала. Инструменты, стеклянную посуду, кюветы можно залить 5% раствором хлорамина, после чего удалить хлорамин стерильной дистиллированной водой. Для мытья кювет можно использовать автоклавированную тряпку.

Четвертый принцип - сохранение нуклеиновых кислот в пробе от разрушающего действия нуклеаз (ферментов разрушающих нуклеиновые кислоты). На стадии отбора биоматериала, его хранения и транспортировки, данный принцип реализуется путем создания неблагоприятных для работы нуклеаз условий - замораживание, либо высушивание проб.

 

3. Пробоподготовка

 

Вскрытие

1.     Вскрываем птицу стараясь не касаться ножницами органов и тканей от которых намереваемся получить материал.

2.     Обжигаем ножницы над пламенем горелки

3.     Аналогичным образом поступаем с пинцетом (желательно маленьким, глазным)

4.     Рассекаем обожженными ножницами толщу органа, либо вскрываем просвет трубчатого, полостного органа

5.     Из пробирки берем пинцетом треугольник из специальной бумаги и вносим в разрез, пропитываем тканевой жидкостью и сразу переносим в пробирку, которую маркируем

6.     В каждую пробирку одним одноразовым наконечником с фильтром внести по 1 мл. консервирующей жидкости (стараясь не касаться носиком стенок пробирок)

7.     Пробы хранятся при комнатной температуре не менее 3 недель [1].

 

Отбор крови на ПЦР

1.     Кровь собирается в одноразовые пробирки (желательно с трилоном Б или гепарином (в сопроводительной тип антикоагулянта должен быть указан или согласован с исследователем)).

2.     Кровь следует отбирать путем прокола подкрыльцовой вены одноразовым скарификатором, для каждой птицы следует использовать отдельный скарификатор.

3.     Допускается взятие крови без антикоагулянта с целью параллельного отбора сыворотки на ИФА (но с использованием одноразовых носиков и посуды).

4.     Одноразовым наконечником в пробирку с сорбционным носителем внести 10-12 мкл. крови

5.     В каждую пробирку одним одноразовым наконечником с фильтром внести по 1 мл. консервирующей жидкости (стараясь не касаться носиком стенок пробирок).

 

Выделение ДНК

1.     после транспортировки или хранения проб в течение до 3-х недель при комнатной температуре, слить консервирующую жидкость.

2.     промыть пробу 0,5 мл. раствора для промывки №1

3.     промыть пробу 0,5 мл. раствора для промывки №2

4.     элюировать ДНК с сорбента в 150 мкл ТЕ буфера 30 мин. при температуре 60 ^оС.

 

         Пробоподготовка для постановки ПЦР на наличие геномной ДНК бактерий в пробах корма и кормовых ингридиентов

1.     Делается суспензия 1-гр корма в 9 мл. физиологического раствора. Пробу в 50 мл флаконе тщательно перемешивают на шейкере в течение 30 минут, затем оставляют на 10-15 мин для седиментации плотных частиц корма, после чего отбирают 1-2 мл надосадочной жидкости.

2.     Пробу центрифугируют при 5 тыс. об/мин 1 мин. Супернатант сливают.

3.     К осадку добавляют 300 мкл лизирующего раствора из набора ДНК-сорб Б фирмы «интерлабсервис» и ресуспендируют на вортексе. Пробирку прогревают в течение 5 минут при 60 С.

4.     Пробу перемешивают и центрифугируют при 5 тыс. об/мин 1 мин.

5.      Супернатант переносят в другую пробирку и добавляют 50 мкл силики. 

6.     Дальнейшие этапы исследования производят в соответствии с инструкцией прилагаемой к набору для выделения.

 

Отбор проб ДНК из яиц

Материалы и оборудование: набор для выделения ДНК «ДНК-сорб Б» фирмы «Интерлабсервис», одноразовые наконечники с фильтром на 1000 и 250 мкл, центрифуга, вортекс.

 Техника пробоподготовки:

1.     Для исследования желтка или белка отбирается 0,1 мл соответствующего компонента яйца, к нему добавляется 300 мкл лизирующего буфера и 500 мкл хлороформа.

2.     Смесь тщательно перемешивают на вотексе и оставляют на 5 минут при комнатной температуре.

3.     Центрифугирют при 5 тыс об.мин 1 мин.

4.     Супернатант переносят в другую пробирку и добавляют 50 мкл суспензии сорбента.

5.     Дальнейшие этапы исследования производят в соответствии с инструкцией прилагаемой к набору для выделения.

Быстрый скрининговый метод подготовки проб из единичных колоний

Бактериальной петлей отбирают частичку колонии и переносят в одноразовую пробирку с 100 мкл стерильной дестиллированной воды. Культуру ресуспендируют и прогревают при 95^оС 10-15 мин. Пробирку центифугируют при максимальных оборотах 1-3 минуты.

 

 

4. Постановка ПЦР, рестрикция и электрофорез

ПЦР  проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис.-HCl (рН  8,9), 16 мМ сульфат аммония; 2,4 мМ MgCl₂; 0,01% Твин 20; 0,2 mM дНТФ; 0,3 mкM растворы олигонуклеотидных праймеров, и 1ед.  Taq-полимеразы.

Для детекции геномной ДНК P. aerugenosa добавлются олигонуклеотды со следующей структурой:

1         GCTATCCCCCTGGTTCCATT      

2         GACATCTCCATAGGGACCGC   

Для детекции геномной ДНК микроорганизмов рода Pasterella   были найдены следующие последовательности  специфичные для гена 16s рибосомальной РНК

3            TGCCATAAGATGAGCCCAAGT      

4            GCCCTTTACGCCCAGTTA     

Реакцию проводят на амплификаторе типа «Терцик» (НПФ ДНК-Технология, Россия) или с использованием его аналога, с начальной денатурацией при 95°С 3 мин., далее в течение 36 циклов с денатурацией при 95° С 10 сек, отжигом при температуре 62 -64°C в течение 10 сек и синтезом при 72° С 15 сек. Финальная элонгация проводится при 72° С 3 мин.

Для детекции геномной ДНК P. aerugenosa длинна ампликона должна составлять 283 пн Для детекции геномной ДНК микроорганизмов рода Pasterella длинна ампликона должна составлять 360 пн

Экспериментальный подбор оптимальной температуры отжига позволил установить что в мультиплексной ПЦР целесообразно использовать температуру 64 С Так как была установлена более низкая эффективность синтеза ампликонов при использовании праймеров на пастереллу в смеси с праймерами на псевдомонас. праймеры на пастереллу и псевдомонас должны добавляться в реакционную смесь в соотношении 2:1.

   1       2         3          4        5       6       

 

 

 

 

                                      PAE                                        

                    PAS                                                            710п.н.

                                                                                       489п.н.

                                                                                       404п.н.                      

                                                                                       323п.н.

                                                                                                         242п.н.                 

 

 

 

 

Рис.2 Результаты мультиплексной ПЦР на наличие геномной ДНК СГП и пастерелл

Примечание: Трек 1 – к-, трек 2 ПЦР на пастереллу добавлена ДНК ПАЕ, трек 3 ПЦР на пастереллу добавлена ДНК ПАS, трек 4 ПЦР на PAE/PAS добавлена ДНК PAS, трек 5 ПЦР на PAE/PAS добавлена ДНК PAE, трек 6 ПЦР на PAE/PAS добавлена ДНК PAE/PAS

 

Для верификации результатов ПЦР на пастереллу можно провести дополнительный контроль специфичности. Аликвоты ПЦР реакционной смеси объемом 10 мкл следует использовать для ПДРФ анализа. Рестрикцию продукта амплификации проводят в течение 16 часов при температуре 37°С, 2 ед. эндонуклеазы рестрикции Alu I. При гидролизе ферментом рестрикции образцов с наличием геномной ДНК пастерелл появляются 2 фрагмента  соответствующие размеру 94 и 366 п.н..

 

5. Вопросы интерпретации информации и методы обработки результатов.

Принципиально важно при планировании и анализе результатов ПЦР исследований учитывать сопутствующие патологоанатомические, эпизоотологические и клинические проявления инфекционного процесса.

Учитывая высокую патогенность пастерелл, сам факт индикации геномной ДНК микроорганизмов рода пастерелла, может иметь большое диагностическое значение и служить основанием для принятия каких либо мер противоэпизоотической направленности.

Тем не менее, немаловажное значение имеет доказательство ассоциированности выявленного инфекционного агента и конкретной нозологической формы. Например, если на птицефабрике были отмечены массовые поражения суставов, и предполагается пастереллезная этиология, то и геномная ДНК пастерелл должна выявляться в большинстве пораженных суставов, и как минимум, процент положительных проб у клинически здоровой птицы должен быть меньше.

Аналогичная ситуация возникает когда необходимо доказать роль пастереллеза или псевдомоноза в повышенном отходе птицы. Если у павшей птицы уровень инфицированности инфекционным агентом выше, чем у клинически здоровой (при отборе проб из тех же органов и тканей), то можно говорить о постановке диагноза пастереллез (с учетом верификации диагноза комплексом бактериологических, эпизоотологических и патологоанатомических методов).

Для диагностики псевдомоноза с использованием метода ПЦР значимым моментом является правильный отбор проб. Например, являясь сапрофитическим микроорганизмом, СГП встречается в воздухе, и соответственно может встречаться в респираторной системе и у клинически здоровой птицы. В данной ситуации важно выявить факт септического процесса и наличие геномной ДНК СГП в органах и тканях не контактирующих с окружающей средой в норме т.е. сердце, почках, печени.

Факт обнаружения геномной ДНК  СГП в легких имеет значение при исследовании эмбрионов и суточных цыплят, т.к. помимо диагностического значения отражает низкую санитарную культуру в инкубатории.

В системе микробиологических исследований ПЦР также может быть использован на стадии идентификации возбудителя, либо на промежуточном этапе культивирования для определения стратегии получения чистой культуры.

Например, при посеве пробы, выросшие колонии параллельно с пересевом на дифференциально-диагностические среды можно типировать на принадлежность к пастереллам или псевдомонасам. Учитывая, что пигментообразование характерное для СГП может развиваться в течение 7 суток, такой тест вполне обоснован.

Специфичность и достоверность ПЦР. При оценке степени достоверности результатов ПЦР следует учитывать такие параметры как наличие характерных признаков заболевания, свежесть материала, качество хранения и транспортировки проб. Специфичность ПЦР исследования определяется суммой тканеспецифичности возбудителя и специфичности самого теста. Например, если в верхних дыхательных путях вполне возможно наличие не только синегнойной палочки но и широкого спектра близкородственных непатогенных бактерий, то в сердце скорее всего сможет проникнуть только бактерия обладающая патогенными свойствами т.е. СГП. Другим критерием является контагиозность инфекционных агентов, если в стаде обнаружена всего одна птица во внутренних органах которой выявлена ДНК пастерелл, как минимум скорее всего это слабопатогенная бактерия и наоборот, 80% уровень инфицированности паренхиматозных органов – серьезный факт свидетельствующий в пользу патогенности возбудителя.

При использовании ПЦР в системе микробиологического анализа чувствительность и специфичность ПЦР возрастает в значительной степени т.к. само использование питательных сред и режимов культивирования ограничивает возможность неспецифических реакции на посторонние виды бактерий в виду ограничения видового спектра бактерий в процессе культивирования, например, среди псевдомонасов крайне редки виды растущие при 37 ^оС, а рост при 42^оС для СГП относят к видоспецифичным признакам.

Для повышения надежности ПЦР-диагностики мы рекомендуем систему пост-ПЦР контроля базирующуюся на дополнительном анализе ПЦР продуктов методом рестрикции, а в спорных случаях и секвенирование.

 

6.  Заключение: разработанная нами мультиплексная ПЦР для детекции как элемент общей системы диагностических мероприятий целесообразно использовать для дифференциальной диагностики септических патологий и пневмоний бактериальной и вирусной патологии, и, в ряде случаев контроля эффективности противоэпизоотических мероприятий.

 

 

 

 

 

 

 

 

7. Литература:

 

1.     Юшков А.Г., Афонюшкин В.Н., Городов В.С., Леонов С.В. Модификация методики ISOCODE с целью выделения больших объемов проб ДНК // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: материалы международной научной конференции молодых ученых. -, Владимир 2004г. –С.146-149

2.     Derieux W.T., 1978. Responses of young chickens and turkeys to virulent and avirulent Pasterella multocida administered by various routes. Avian dis. 22:131-139

3.     Hall W.J., Heddleston K.L., Legenhausen D.H. et al. 1955. Studies on Pastererellosis: I. A new species of Pasterella encountered in chronic fowl cholerae. Am. J. Vet. Res. 16:598-604

4.     Nicolet J. and Fey H., 1965 Role of Pasterella haemolytica  in salpingitiis of fowls. Schweiz Arch. Tiercheilkd 107:329-334

5.     Pritchett I.W., Hughes T.P., 1932 The epidemiology of fowl cholera VI. Field observations of the spontaneous disease. J. Exp. Med. 51:249-258

6.     Williams B.J., Newkirk H.L. 1966. Pseudomonas infection of one-day chicken resalting from contaminated antibiotic solutions. Avian Dis. 10:353-356