Разработка мультиплексной ПЦР для детекции геномной ДНК P. aerugenosa и микроорганизмов рода Pasterella в патологическом материале сельскохозяйственной птицы.

Афонюшкин В.Н., Коптев В.Ю., Юшков Ю.Г., Шкиль Н.А.

ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока

 

Проблемы индикации актуальных для ветеринарии возбудителей бактериальных инфекций стоят достаточно остро. Существует потребность в массовом, высокочувствительном и специфичном методе. ПЦР для выявления отдельных возбудителей бактериозов в патологическом материале недостаточно эффективна ввиду узкой специфичности. В то же время классические бактериологические исследования имеют такие недостатки как: длительность исследований, наличие некультивируемых форм бактерий, сложность выделения культуры из организма обработанного антибиотиками, сложность детекции инфекционных агентов при ассоциированных инфекциях.

Мультиплексная ПЦР позволяющая контролировать наличие определенного спектра микроорганизмов в одной реакции, не имеет вышеупомянутых недостатков.

Задачей нашего исследования является разработка дуплексного варианта ПЦР для детекции геномной ДНК пастерелл (PAS) и синегнойной палочки (PAE).

Материалы и методы

Поиск праймеров для детекции геномной ДНК Pasterella multocida et gallinarum, Pseudomonas aerugenosa с использованием нуклеотидных последовательностей вышеупомянутых бактерий найденных в базах данных Genbank. Для моделирования ПЦР использовалось программное обеспечение Lasergene, VectorNTI и др.

С целью накопления тест объектов – культур данных бактерий проводили изоляцию этих видов из патологического материала кур с признаками респираторной патологии, с использованием общеупотребимых методов, также использовали ДНК выделенную из вакцин.

Выделение ДНК из культур и патологического материала проводили как с использованием метода FastDNA так и методики предложенной нами.

Выделение ДНК пастереллы из инактивированной эмульгированной вакцины против пастереллеза птиц, после удаления липидов хлороформом, осуществляли с использованием набора ДНК сорб Б производства фирмы  «Интерлабсервис».

 

Результаты собственных исследований и обсуждение

 

Были подобраны праймеры для детекции геномной ДНК P. aerugenosa со следующей структурой:

1         GCTATCCCCCTGGTTCCATT      

2         GACATCTCCATAGGGACCGC   

Расчетная длинна ампликона составляет 283 пн. Расчетная температура плавления 54,3   и 53,2 С, соответственно.

Для детекции геномной ДНК микроорганизмов рода Pasterella   были найдены следующие последовательности  специфичные для гена 16s рибосомальной РНК

3            TGCCATAAGATGAGCCCAAGT      

4            GCCCTTTACGCCCAGTTA     

Расчетная длинна ампликона должна составлять 360 пн. Расчетная температура плавления 50,3     и  53,8 ^оС, соответственно. Помимо сходных температур плавления, по расчетным данным эти праймеры не должны образовывать стабильных гетеродуплексов друг с другом.

Таблица 1.

Температурные режимы реакции

Этап	Температура, оС	Время	Кол-во циклов
1	95	3 мин.	1
2	95	15 сек.	42
	52	10 сек.
	72	30 сек.
3	72	1 мин.	1

 

Экспериментальный подбор оптимальной температуры отжига позволил установить что в мультиплексной ПЦР целесообразно использовать температуру 52^оС (см. рис. 1 и табл. 2).

 

 

     54 ^оС               52 ^оС            50 ^оС                pBS/MSP

 

 

 

 

                                      PAE                                        

                    PAS                                                            710п.н.

                                                                                       489п.н.

                                                                                       404п.н.                      

                                                                                       323п.н.

                                                                                                         242п.н.                 

 

 

 

 

Рис. 1 Подбор оптимальной температуры отжига праймеров.

 

 В процессе работы была установлена более низкая эффективность синтеза ампликонов при использовании праймеров на пастереллу в смеси с праймерами на псевдомонас. В опытах было установлено что праймеры на пастереллу и псевдомонас должны добавляться в реакционную смесь в соотношении 2:1.

Для того чтобы избежать ингибирования синтеза ампликонов при наличии ДНК обоих групп микроорганизмов была подобрана минимальная концентрация праймеров достаточная для синтеза обоих ампликонов (см. рис. 2).

 

   1       2         3          4        5         6         7         8         9        10

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Рис. 2 Подбор оптимальной концентрации праймеров в реакционной смеси.

Примечание положительные контроли РАЕ, PAS (трек 2, 3) PAS/pae (трек 4), раститровка праймеров 1:1(250нМ), 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 (треки 4,5, 6, 7, 8, 9). Трек 10 маркер молекулярного веса pBS/MSP1, трек 1 отр. контроль

Таблица 2

Изучение специфичности мультиплексной ПЦР

	Проба ДНК	Результат ПЦР на PAS	Результат ПЦР на PAE
1	P. aerugenosa полевой изолят	-	+
2	P. vulgaris полевой изолят	-	-
3	P. vulgaris полевой изолят	-	-
4	+ контроль PAE из ПЦР набора фирмы «биоком»	-	+
5	Патологический материал от птицы без признаков псевдомоноза и пастереллеза	-	-
6	Патологический материал птицы без признаков псевдомоноза и пастереллеза	-	-
7	E. coli ATCC 25922	-	-
8	Патологический материал от птицы из благополучной по псевдомонозу и пастереллезу птицефабрик	-	-
9	Патологический материал от птицы из благополучной по псевдомонозу и пастереллезу птицефабрик	-	-
10	Патологический материал от птицы из благополучной по псевдомонозу и пастереллезу птицефабрик	-	-
11	L. monocitogenes	-	-
12	Патологический материал от птицы из благополучной по псевдомонозу и пастереллезу птицефабрик	-	-
13	I. pseudotuberculosis	-	-
14	E. coli полевой изолят	-	-
15	Serratia marcescens	-	-
16	S. aureus	-	-
17	Pasterella	+	-
18	К -	-	-

 

Опыты по оценке специфичности реакции показали достаточную специфичность (см. табл. 2).

         К негативным факторам ограничивающим применение мультиплексных ПЦР в системе скрининга и мониторинга различных инфекций относят более высокий риск неспецифических реакций ввиду наличия в реакционной смеси нескольких пар праймеров и снижение чувствительности реакции в связи с конкуренцией за компоненты реакционной смеси при синтезе нескольких разных ампликонов.

         Однако в ветеринарной практике, точность ПЦР имеет меньшее значение ввиду того, что ветеринарные инфекционисты работают с группами животных, в отличие от медиков. Поэтому для ветеринарии мультиплексные ПЦР перспективны не только для типирования культур микроорганизмов в процессе микробиологических исследований, но и для работы с патологическим материалом.

Пастереллез и псевдомоноз с./х птицы обычно сопровождается инфицированием одних и тех же органов и тканей (легкие, сердце, паренхиматозные органы) поэтому использование мультиплексной ПЦР будет вполне уместно для дифференциальной диагностики, в то же время биологические особенности пастерелл и псевдомонасов не создают существенных предпосылок для развития ассоциированных инфекций. В этой связи, риск конкурентного ингибирования одной из реакцию – минимален.

 

Заключение: проведенные исследования позволили разработать образец тест системы детектирующей геномную ДНК микроорганизмов рода Pasterella и P. aerugenosa в дуплексном режиме, что позволит снизить трудозатраты на проведение ПЦР мониторинга данных инфекций в два раза, а также в 1.5 раза уменьшит расход реагентов.