Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота, новый метод индикации вируса в патологическом материале
.ГНУ ИЭВСиДВ
На сегодняшний день открыто большое количество возбудителей инфекционных болезней сельскохозяйственных животных. . Подчас бывает сложно установить возбудителя, играющего ведущую роль в развитии патологического процесса из-за слабой чувствительности и специфичности традиционных методов диагностики и частого смешанного течения большинства заболеваний. Учитывая важность постановки диагноза в ранние сроки требуется применение более современных методик . Таким требованиям отвечает метод молекулярной гибридизации и созданная на его основе в лаборатории биотехнологии ИЭВСиДВ совместно с НИИ биоинженерии ГНЦ ВБ “Вектор” тест-система
для диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом молекулярной гибридизации, основой которой является однонитиевый ДНК-зонд 13мрВНУ34ЕР . ДНК-зонд сконструирован на основе ДНК фага М13мр8 путем клонирования фрагмента вирусного генома и содержит вставку размером 1400 пар нуклеотидов. Чувствительность ДНК-зонда составляет 1-10 пГ вирусной ДНК.Метод ДНК-гибридизации in situ наряду с обзорностью гистологического метода обеспечивает достаточную специфичность для выявления вируса ИРТ на тканевом и клеточном уровнях. Теоретически для постановки диагноза достаточно будет выявить одну пораженную вирусом клетку, что ставит этот метод по чувствительности в один ряд с ПЦР. Это позволит не только идентифицировать вирус ИРТ, но и изучать достоверно патогенез заболевания при острой и особенно латентной форме заболевания
В доступной нам отечественной литературе, мы не встречали упоминаний о реакции ДНК-гибридизации in situ с целью идентификации вируса ИРТ на гистологических срезах. Однако был разработан метод ускоренной идентификации ИРТ КРС в культуре клеток с помощью точечной молекулярной гибридизации.(Гаджиев Б.М. 1991). Аналогичные методы на гистосрезах с помощью радиоактивных зондов применялись зарубежными авторами ( Ackerman M. et Wyller R.,
1984) и другими.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Для отработки реакции был отобран следующий пат. материал от крупного рогатого скота: кусочки легкого от 2х голов и носовая перегородка. Пробы предварительно были исследованы на ИРТ методом блот гибридизации (Глотов и др) Для гистологического исследования и ДНК гибридизации на гистосрезах, были взяты как заведомо положительные, так и заведомо отрицательные на ИРТ пробы.
Кусочки ткани фиксировались в 10% забуференном растворе формалина в течении 24ч и промывали в проточной воде 12ч. Мы использовали стандартную методику проводки и заливки материала в парафин. Срезы толщиной 3-5мкм монтировались на чистые обезжиренные предметные стекла.
Депарафинирование срезов осуществляли в ксилоле с последующей доводкой до дист. воды через батарею спиртов нисходящей концентрации.
Метод ДНК-гибридизации in situ проводился по модифицированной нами “Методике по диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота методом молекулярной гибридизации”
После тщательной промывки в дистиллированной воде срезы подвергали частичному протеолизу раствором протеиназы К. После инкубации срезы тщательно отмывали в дист. воде и разрушали протеиназу нагреванием.
Затем срезы промывали реакционным буфером и наносили предгибридизационную смесь.
Линеаризацию ДНК осуществляли нагреванием до 92С с последующим резким охлаждением стекол на льду. Затем на срезы наносили биотинилированный зонд и закрывали их покровными стеклами. Гибридизация протекала при температуре 65С, во влажной камере, в течении ночи
.После гибридизации отмывали не связавшийся зонд дистиллированной водой и блокирующим буфером.
На срезы наносили коньюгат авидина и щелочной фосфатазы. Инкубировали 30 мин. при 37 С во влажной камере. После промывки буфером, с целью выявления щелочной фосфатазы, наносили субстрат нитротетразолевый синий / 5-бром-3-индолил-фосфат . Инкубировали при 37 С, 20 минут.
Срезы отмывали от излишка красителя и докрашивали ядра клеток 0,1% водным раствором сафранина. Заключали препараты в 0,8% раствор расплавленной агарозы.
Положительная реакция характеризовалась появлением черно-коричневых гранул в цитоплазме клеток.
Описание патогистологической картины.
Отчетливо видна тропность вируса к многослойному неороговевающему эпителию слизистой носа, эпителию альвеолярно-трубчатых белково-слизистых желез локализованных в подслизистом слое и отчасти эндотелию кровеносных сосудов иммуно-компетентных клеток и хондроцитам. В цитоплазме фибробластов и фиброцитов локализации вируса не отмечалось. Наличие вируса в клетке характеризовалось появлением черно-коричневых гранул субстрата щелочной фосфатазы ( ) являющейся маркером ДНК зонда. Нередко гранулы полностью заполняли пораженную клетку
Вирус поражал все слои многослойного неороговевающего эпителия слизистой оболочки. В слизистой, пораженной вирусом, изредка встречались свободные от вируса участки. Местами слизистая оболочка была десквамирована. В подслизистом слое наблюдалесь умеренная, преимущественно сегментоядерная инфильтрация. Иммунокомпетентные клетки так же давали положительную реакцию на наличие ДНК вируса. Инфильтративные процессы более глубоких слоев носовой перегородки, не контактирующих с окружающей средой, но также пораженных вирусом, были выраженны слабее. Это свидетельствует о значительной роли вторичной микрофлоры в развитии воспалительного процесса. Обильное накопление субстрата щелочной фосфатазы отмечалось в эпителиоцитах альвеолярно-трубчатых белково-слизистых желез. Несколько меньшее количество субстрата отмечалось в
эндотелиоцитах гиперемированных сосудов и капилляров, локализующихся в подслизистом слое.Выраженных патоморфологических изменений хряща носовой перегородки мы не отметили. Однако в цитоплазме большинства хондроцитов колонковой зоны и зоны изогенных групп, мы зарегистрировали мелкие гранулы субстрата. Количество гранул варьировало в пределах нескольких десятков. В матриксе хряща и клетках других зон хряща вирус не был обнаружен.
К вопросу об изучении тропности вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота с помощью реакции ДНК гибридизации на гисто-срезах.
Материалы и методы
Исследования проводились на базе лабораторий биотехнологии, генной инженерии, оптимизации противоэпизоотических мероприятий ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН.
Материал был получен
Метод ДНК-гибридизации in situ проводился с использованием биотинилированного ДНК-зонда к фрагменту генома вируса ИРТ , созданный ( ) Для идентификации вируса мы использовали метод ДНК гибридизации in situ разработаный ().
Описание патогистологической картины.
Отчетливо видна тропность вируса к многослойному неороговевающему эпителию слизистой носа, эпителию альвеолярно-трубчатых белково-слизистых желез локализованных в подслизистом слое и отчасти эндотелию кровеносных сосудов иммуно-компетентных клеток и хондроцитам. В цитоплазме фибробластов и фиброцитов локализации вируса не отмечалось. Наличие вируса в клетке характеризовалось появлением черно-коричневых гранул субстрата щелочной фосфатазы ( ) являющейся маркером ДНК зонда. Нередко гранулы полностью заполняли пораженную клетку
Вирус поражал все слои многослойного неороговевающего эпителия слизистой оболочки. В слизистой, пораженной вирусом, изредка встречались свободные от вируса участки. Местами слизистая оболочка была десквамирована. В подслизистом слое наблюдалесь умеренная, преимущественно сегментоядерная инфильтрация. Иммунокомпетентные клетки так же давали положительную реакцию на наличие ДНК вируса. Инфильтративные процессы более глубоких слоев носовой перегородки,
не контактирующих с окружающей средой, но также пораженных вирусом, были выраженны слабее. Это свидетельствует о значительной роли вторичной микрофлоры в развитии воспалительного процесса. Обильное накопление субстрата щелочной фосфатазы отмечалось в эпителиоцитах альвеолярно-трубчатых белково-слизистых желез. Несколько меньшее количество субстрата отмечалось в эндотелиоцитах гиперемированных сосудов и капилляров, локализующихся в подслизистом слое.Выраженных патоморфологических изменений хряща носовой перегородки мы не отметили. Однако в цитоплазме большинства хондроцитов колонковой зоны и зоны изогенных групп, мы зарегистрировали мелкие гранулы субстрата. Количество гранул варьировало в пределах нескольких десятков. В матриксе хряща и клетках других зон хряща вирус не был обнаружен.
При исследовании гистологического препарата носовой перегородки крупного рогатого скота нами было выявленно наличие ДНК вируса ИРТ в цитоплазме хондроцитов эластического хряща. Необходимо отметить, что в доступной нам литературе не встречалось упоминаний о репродукции вируса в хрящевой ткани, вообще, и в эластическом хряще носовой перегородки, в частности. К сожалению мы пока не располагаем большой выборкой препаратов исследованных вышеупомянутым методом. Однако полученные данные уже позволяют, как минимум, констатировать факт локализации вируса ИРТ в хондроцитах.
Метод ДНК-гибридизации in situ наряду с обзорностью гистологического метода обеспечивает достаточную специфичность для выявления вируса ИРТ на тканевом и клеточном уровнях. Это позволит не только идентифицировать вирус ИРТ, но и изучать его роль в течении патологического процесса . Мы считаем, что данный метод может позволить получить новые данные касающиеся механизмов вирусовыделения и заражения.
E-mail: lisocim@mail.ru
- Главная страничка каталога -