(ГНУ ИЭВСиДВ - СибАгроТрейд)

Принцип метода: основан на определении чувствительности к антибиотикам микрофлоры обработанной каким либо антибиотиком в сравнении с интактными культурами или микробиоценозами.

Материалы: чашка петри с агаром и дисками, планшета с нанесенными антибиотиками, МПБ, ридер со светофильтром 492-495нм, термостат, компъютер.

В горизонтальные рядки раскапываются пробы, например ряд А – тетрациклин резистентная (tetR) E.coli, ряд В – энрофлоксацин резистентная E.coli и т.д. В последний горизонтальный ряд вносятся необработанные антибиотиком микроорганизмы. Если выделено несколько видов, то и контрольных рядов может быть несколько. Последний вертикальный ряд не содержит антибиотиков.

1. высеять пробу газоном на МПА и положить диски с антибиотиками по общепринятым методикам (работа с культурой или “быстрая” антибиотикограмма.)

2. из зоны задержки роста, или на ее границы взять бак. петлей материал из единичной колонии и развести его на МПА в объеме 2.5 мл. так же поступить с остальными зонами задержки роста высевая антибиотикорезистентные изоляты в отдельные пробирки.

3. из участка газона удаленного от зон задержек роста взять образец интактной микрофлоры и поместить в пробирку

4. следует добиваться одинаковой мутности суспензии главное не вносить слишком много бактерий

5. раскапать суспензию из пробирок по горизонтальным рядам плашки по 200 мкл. в лунку. Каждой пробирке соответствует отдельный горизонтальный ряд.

6. все схемы размещения проб должны быть зафиксированы в журнале.

7. закрыть плашку стерильной крышкой и поставить в термостат при 37С на 12-16 ч.

8. инактивировать выросшие микроорганизмы путем облучения УФ – лампой 30-60 мин.

9. фотометрировать на вертикальном спектрофотометре (ридере) используя светофильтр 492 нм

10. полученные оптические плотности скопировать в буфер обмена и вставить в таблицу Exel для обработки

11. над таблицей оптических плотностей имеются 2 колонки для указания проб и антибиотиков в колонке№1 лучше написать антибиотик к которому резистентен или которым обработан микроорганизм, колонка№2 для антибиотиков которые внесены в плашку

12. в результате будет получена таблица с данными задержки роста по отношению к контролю без антибиотиков (процент задержки роста). Чем больше цифра, тем более активен антибиотик для данного микроорганизма.

В принципе, анализ процента задержки роста позволяет утверждать о наличии или отсутствии чувствительности микроорганизмов к тому или иному антибиотику в терапевтической концентрации. Если ставится только это задача, то достаточно просто отвить и высеять на плашки любые изоляты, которые Вас интересуют.

Рекомендовать к использованию естественно следует только те антибиотики, у которых наиболее высокий процент задержки роста и он не должен быть менее 20% (т.к. прибор калибруется на воздух, на самом деле вы не получите 100% задержки роста даже там где рост отсутствует, из-за необнуленной оптической плотности питательной среды, но это упрощает технику постановки и снижает вероятность и величину некоторых погрешностей).

Для выявления перекрестной антибиотикорезистентностии, или, нередко, случаев повышения чувствительности микрофлоры к одному антибиотику после обработки другим следует следует сравнивать процент задержки роста в пробе с процентом задержки роста интактной микрофлоры по отношению к тому же антибиотику. Превышение процента задержки роста опытной пробы по сравнению с интактной микрофлоры не менее, чем на 10% позволяет говорить о повышении чувствительности микрофлоры к антибиотику второго эшелона после обработки антибиотиком первого эшелона (тот антибиотик которым была обработана микрофлора на чашке петри). Если, наоборот, у интактной микрофлоры процент задержки роста выше чем в опытной пробе то можно говорить о формировании антибиотикорезистентности. Мы копируем таблицу в Word и помечаем результаты разными цветами (рис.2)

После оценки снижения или повышения устойчивости к антибиотикам следует оценить стабильность работы антибиотика который находится в плашке. И необходимо учесть неблагоприятное действие антибиотиков, которыми была обработана микрофлора перед посевом на плашку, если сам антибиотик работает хорошо, но вызывает развитие перекрестной резистентности к большому количеству других антибиотиков то перспективы его использования сомнительны.

Важный прогностический критерий – оценка скорости падения чувствительности микрофлоры к антибиотику, например, из зоны задержки роста энрофлона высеяли эшерихию и в лунке с энрофлоном получили падение чувствительности на 25% по сравнению с интактной культурой. Это довольно хороший показатель, если бы он превышал 80%, прогноз был бы очевиден. Иногда на очень хорошо и стабильно работающий антибиотик отмечается повышение чувствительности микрофлоры к нему же ввиду повреждения данным антибиотиком биохимических защитных механизмов. Иногда наоборот, какой либо не очень активный, но стабильный антибиотик на практике оказывается эффективнее антибиотиков дающих большие зоны задержки роста.

Объекты исследования: это может быть чистая культура, либо микробиоценоз. Работа с чистыми культурами актуальна для моноинфекций, в противном случае, вам придется на каждый элемент микробиоценоза выделять отдельную плашку. Последний вариант тоже возможен но требует комплексного анализа больших массивов информации с использованием автоматизированных экспертных систем и баз данных (часть мы уже разработали). Работа с микробиоценозом подразумевает использование быстрой антибиотикограммы. Под интактным контролем обычно подразумевается весь микробиоценоз. К нему могут быть добавлены интактные изоляты. В связи с этим различные компоненты микробиоценоза могут быть резистентны к различным антибиотикам, причем вся совокупность их свойств определяет устойчивость к анетибиотикотерапии всего микробиоценоза в целом.

Наиболее примитивный вариант – отслеживать стабильность работы того или иного антибиотика, констатировать наличие фактов перекрестной антибиотикорезистентности.

Построение модели реакции микробиоценоза на антибиотики, включающее анализ механизмов антибиотикорезистентности, функциональной роли отдельных сочленов миробиоценоза, скрининг синергичных сочетаний антибактериальных препаратов в параллельном и последоватьельном применении и т.д. по большей части разработано нами но пока не может быть внедрено впрактику до тех пор пока мы не завершим работы по созданию автоматизированных экспертных систем и баз данных а также специализированного оборудования позволяющего исследовать большой объем проб.

Мы проводим экологические исследования популяций собак и кошек, заполните пожалуйста нашу aнкетуЭто нужно для того, чтобы научится мирному сосуществованию с ними, сократить до минимума уничтожение бездомных животных, повысить эффективность борьбы с инфекциями