Перспективы использования методов генодиагностики в ветеринарной практике

Афонюшкин В.Н., Юшков Ю.Г., Городов В.С.

(Сектор болезней птиц ГНУ-ИЭВСиДВ )

В последние годы наблюдается настоящий бум в области разработки диагностических методов основанных на выявлении нуклеиновых кислот вирусов и бактерий. Сегодня, большинство таких методов основаны на полимеразной цепной реакции (ПЦР) и реакции молекулярной гибридизации.

Почему это происходит? Нуклеиновые кислоты – носители генетической информации определяют биологические свойства бактерий и вирусов. Вполне естественно, что различия, например, между различными штаммами бактерий связаны с различиями в строении их ДНК и РНК. Соответственно, методы основанные на выявлении этих различий в строении нуклеиновых кислот могут служить для индикации того или иного вида микроорганизмов в биологическом материале.

Каков механизм, обусловливающий специфичность этих методов? И в ПЦР и в моллекулярной гибридизации основой является специфическое связывание искусственного фрагмента нуклеиновой кислоты с идентичным ему по строению участком нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) бактерии или вируса. В молекулярной гибридизации таким искусственным фрагментом является зонд, в ПЦР участвуют как минимум два таких фрагмента именуемые праймерами (затравками). Молекулярная гибридизация по механизму довольно проста, собственно говоря, она мало чем отличается от ИФА, которую тоже относят к этой группе реакций. Если в пробе сорбированной на твердой подложке присутствует идентичный (комплементарный) зонду участок ДНК то зонд свяжется с ним и останется, после отмывки, в месте нанесения пробы. В связи с тем, что молекула зонда метится радиоактивным изотопом или ферментом как в ИФА, то после выявления этой метки, мы можем определить, в какой из проб исследуемого материала присутствует нуклеиновая кислота того или иного вируса.

Полимеразная цепная реакция, она же реакция амплификации (Amplification -усиление) немного сложнее. Специфичность реакции также определяется связыванием небольших синтетических фрагментов ДНК (праймеров) с комплементарными им участками ДНК изучаемого вируса. Там где эти праймеры прикрепились запускается синтез новых небольших молекул ДНК строго определенной длинны. Длина молекулы определяется расстоянием между праймерами. На вновь синтезированную молекулу опять гибридизируются такие же праймеры инициируя синтез новой молекулы этот цикл повторяется 20 –30 раз. Представим, что у нас в пробе всего одна молекула геномной ДНК вируса, которого мы хотим выявить. В связи с тем, что каждая молекула ДНК состоит из двух цепочек то уже в первый цикл мы получим 4 молекулы ДНК во втором цикле их уже будет 8, затем 16, 32 и т.д. После 20 – 30 циклов молекул будет столько что мы их сможем обнаружить используя метод электрофореза. Так как эти молекулы имеют одинаковую длину, они, даже если будут содержатся в пробе с большим количеством других молекул ДНК, образуют отдельную полосу на электрофореграмме.

Упомянутый выше механизм обеспечивает высокую специфичность реакции, ведь для того чтобы реакция прошла два маленьких зонда – праймера не только должны специфически связаться с ДНК пробы, но они должны быть локализованы на строго определенном расстоянии друг от друга в строго определенной ориентации.

Каковы преимущества методов генодиагностики инфекций по сравнению с традиционными? Прежде всего, какими бы методами мы не выявили вирус или бактерию, в отрыве от эпизоотологии, анализа патологоанатомической картины и т.д., само по себе это мало о чем говорит. Но, тем не менее, закономерно желание выявлять возбудителей инфекционных заболеваний наиболее чувствительными, дешевыми, универсальными и специфичными методами. Во-первых, метод универсален, подготовив специалиста и приобретя оборудование, вы получаете возможность выявлять и вирусы и бактерии и простейших и генетические аномалии и многое другое. Говорить об экономической стороне не приходится если вспомнить какие затраты и оборудование требуется для культивирования клеток. Нельзя забывать и о времени необходимом для выделения вируса или бактерии. И, наконец, самая глобальная проблема. Выделяя вирус на культуре клеток или бактерию, мы в первую очередь выделяем тот инфекционный агент, который наиболее успешно адаптируется и размножается в данной системе культивирования. Очень часто такие виды микробов или вирусов могут замаскировать истинного виновника патологии, особенно когда речь идет о микробно-вирусных ассоциациях.

Недостатки.

  1. Прежде всего следует говорить об интерпретации данных. Чем старее метод диагностики, тем больший массив информации по интерпретации результатов исследования и использованию их в практике накоплен учеными и специалистами.

  2. Высокая чувствительность метода требует и высокой аккуратности в работе.

  3. Наиболее трудно разрешимая проблема – высокая специфичность – один ПЦР набор – одна инфекция. В этом плане, например, бактериологические методы исследований имеют неоспоримые преимущества.

  4. Другая проблема, хотя и решаемая учеными, мы работаем с нуклеиновой кислотой, а не с живой системой поэтому смоделировать чувствительность возбудителя инфекции к антибиотикам или его патогенность довольно сложно.

  5. Серологическая диагностика, нередко более чувствительна, т.к. даже крайне малое количество бактерий локализованное в небольшом патологическом очажке способно вызвать выработку специфических антител. ПЦР будет положительна только если в пробе будет содержатся ДНК этих бактерий. Иными словами отсутствие реакции говорит только об отсутствии возбудителя в пробе пат.материала это не значит, что возбудитель отсутствует в организме.

Почему при всех недостатках количество тест-систем постоянно растет? Конструирование ПЦР или зонда основано на сложнейшем математическом аппарате. Основой для конструирования является изучение нуклеотидных последовательностей. Для работы нередко используют нуклеотидные последовательности уже полученные кем то и размещенные в общедоступной базе данных. Современное програмное обеспечение позволяет не только подобрать оптимальные зонды или праймеры, но и расчитать параметры реакции, смоделировать ее на компьютере с большим количеством разнообразного генетического материала. То есть для конструирования тест-системы достаточно компъютера и интернета. Все это немыслимо для разработки методов ИФА. Даже воплощение результатов конструирования в молекулах не требует такой высокой квалификации как при разработке ИФА. Ведь физико-химические свойства нуклеиновых кислот мало отличаются у разных биологических объектов, соответственно и методы работы с ними не меняются. Для получения ИФА набора требуется выделение и очистка антигенов, для разных антигенов требуются различные методы и реакции. Стоимость оборудования и квалификация персонала для ИФА гораздо выше, чем для ПЦР. Поэтому мы, специалисты в области ПЦР диагностики довольно уверенно можем смотреть в завтрашний день.

Допустим у Вас на птицефабрике ПЦР на Micoplasma galiseptykum положительна, о чем это говорит? Конечно же ни о чем!!! А вот какой процент эмбрионов является носителем, какими патоморфологическими изменениями это сопровождается? Какой процент инфицированных цыплят в разные сроки жизни? Вся ли птица с характерными для микоплазмоза патологическими изменениями имеет микоплазм и в каких органах, какой процент носительства? Есть ли связь между патологией и наличием положительной реакции? Из каких органов микоплазма после проведения антибиотикотерапии исчезает и какие антибиотики при этом наиболее эффективны и когда в антибиотикотерапии потребность может возникнуть опять? А как уровень титров антител препятствует носительству? Какой уровень титров антител к микоплазме галисептикум должен быть, чтобы препятствовать распространению микоплазм в организме птицы, защищают ли гистогематические барьеры микоплазм от вакцинации? И много других вопросов можно задать и решить с помощью методов генодиагностики. Но подчеркиваем все эти вопросы решаются с использованием эпизоотологических подходов и самых разнообразных методов исследований от пат. вскрытия до ИФА.

Немного о будущем и настоящем. Прогресс в области генодиагностики идет как в экстенсивном (новые тест-системы), так и в интенсивном (новые методы) направлениях. Уже есть вложенная ПЦР которая в несколько раз чувствительнее обычной. Есть модификация ПЦР позволяющая определить нуклеотидную последовательность участка ДНК изучаемого инфекционного агента. Приобретает широкое распространение ГП и ПП-ПЦР позволяющая различать штаммы, биовары и серотипы, генетическое родство различных изолятовСтановятся актуальн количественные ПЦР и молекулярная гибридизация, ПЦР в ИФА – формате.

Развитие молекулярной гибридизации тоже не стоит на месте. Гибридизация на гистосрезах позволяет анализировать взаимосвязь патологоантомического процесса и локализации инфекционного агента, изучать патогенез инфекции выяснять роль того или иного микроорганизма в пат. процессе. FISH-метод молекулярной гибридизации дает возможность выявления на одном гистопрепарате 3-х разных инфекционных агентов.

При этом в последние годы появилось еще более перспективное направление - биочипы (ДНК чипы). Небольшая пластинка площадью от 1 до 3 см. позволяет протестировать пробу на наличие в ней нуклеиновых кислот от 1-2 тысяч различных инфекционных агентов, дефектных генов геномной ДНК птицы и т.д.

Следует упомянуть об упрощении методик и одновременном повышении квалификации персонала диагностических отделов птицефабрик. Так, например, некоторые методики молекулярной гибридизации вполне осуществимы на базе ИФА лабораторий. Уже сегодня есть методы выделения ДНК на бумаге не требующие центрифуг и примитивные в исполнении, сухие ПЦР наборы практически не требуют самостоятельного приготовления реакционных смесей, появились амплификаторы осуществляющие учет реакции и передающие данные в компъютер, есть полностью автоматизированные комплексы ПЦР диагностики.

Таким образом, генодиагностике быть, но и исследователям и врачам–практикам еще предстоит найти место этих методов в системе диагностических мероприятий и технологии птицеводства.
E-mail: lisocim@mail.ru

главная страница___форум_______

Рейтинг@Mail.ru

Мы проводим экологические исследования популяций собак и кошек, заполните пожалуйста нашу aнкетуЭто нужно для того, чтобы научится мирному сосуществованию с ними, сократить до минимума уничтожение бездомных животных, повысить эффективность борьбы с инфекциями

Сайт управляется системой uCoz