Из Оклахомской лаборатории болезней домашних животных было получено 103 образца, которые были положительны на ВД-КРС в ОТ-ПЦР. Эти образцы включали: супернатанты от вирусных изолятов, сыворотки и пат.материал. Для определения цитопатогенности биотипа, проводили изоляцию вируса на культуре клеток. 29 из 103 образцов были получены при скрининге на ВД-КРС, 32 от ОАДЛ (вскрытия) и 43 от живых животных с различными клиническими состояниями. В 2-х образцах содержались как цитопатогенный, так и нецитопатогенный биотипы. Из 105 образцов ВД-КРС 26 были 1-го типа цитопатогенного штамма (24,8%), 38 отнесены к 1 типу нецитопатогенного штамма (36,2%), 10 были 2 типа СР штамма (9,5%) и 31 - 2-го типа нецитопатогенного штамма (29,5%). NCP биотип изолировали чаще (65,7), чем СР, и 1-й тип генотипа чаще (61%), чем 2-й.

ВД-КРС вызывает инфекции и заболевания крупного рогатого скота. ВД-КРС-одноцепочечный РНК вирус являющийся членом рода Pestivirus, сем. Flaviviridae. Другие вирусы этого рода также важны в ветеринарном отношении это вирус классической чумы свиней (HCV) и BDV - поражающий овец. ВД-КРС подразделяют по биотипу и генотипу. Цитопатогенный (СР) или нецитопатогенный (NCP) - биотип, устанавливают на основании наличия или отсутствия цитопатического эффекта в культуре клеток. Генотипы (1-го или 2-го типа) идентифицируют методом ПЦР и изучением антигенов(7,9). Тип 1 в дальнейшем подразделяют на 1а и 1в подтипы.

Распространенность различных биотпов и генотипов в диагностических лабораториях важно знать диагностам и практическим ветеринарным врачам. Определение изолятов вируса ВД-КРС также важно потому- что большинство лицензированных вакцин ВД-КРС в США соответствуют ВД-КРС 1-го типа. Тем не менее из недавних сообщений известно, что 1 доза вакцины модифицированного живого вируса ВД-КРС 1го типа защищает телят от клинических проявлений вызываемых вирусом 2-го типа (5). Присутствие вируса 2-го типа в организме животного, вакцинированного 1-м типом, может отражать недостаточно полную защиту, утечку вакцинного штамма, мутацию вируса и/или рекомбинацию формирующую новый вирус.

Вирусы. Из 103 образцов полученных от OADDL мы провели изоляцию вирусов, как описанно в исследовании (10). Оразцы инокулировали в перевиваемую культуру клеток на 24 луночных плашках. Зараженные культуры наблюдали 5-7 дней на наличие цитопатологии и субпассировали через 5-7 дней. Культуры тестировали на ВД-КРС непрямым иммунофлуоресцентным методом. В качестве парвичных антител использовали моноклональные антитела Mabs 15c5 и 20.10.6. Образцы включали супернатанты от вирусных изолятов (n=79), сыворотки (n=17), и пат. материал (n=7) которые были позитивны при изоляции вируса. Биотип устанавливали на основании наличия или отсутствия выраженного цитопатического эффекта. Образцы собирали с ноября 1994 по январь 1998.

ПЦР-анализ. Экстракцию и препаровку вирусной РНК мы осуществляли как описанно в работе (8). Общую РНК от замороженных и оттаянных инфицированных монослоев или вакцины препарировали кислой гуанидин-фенол-хлороформной экстракцией. Эта процедура была модифицированны использованием смеси фенол-хлороформ 5:1 рН 4,5. Кратко, аликвоту 375 мкл вирус содержащей жидкости переносим в 1,5 мл пробирку, куда добавляаем 1,5мкл тРНК (10мг/мл). Затем вносим 375 мкл денатурирующего рабочего раствора (0,35 мл 2-меркаптоэтанола (2 ме/50мл) и 75 мкл 2М ацетата натрия) и перемешиваем содержимое пробирки, переворачивая ее. Добавляем 750 мкл фенол/хлороформа рН 4,5 осторожно перемешиваем , переворачивая пробирку в процессе инкубации на льду в течении 15 минут. Пробирку центрифугируем 10 тыс. g 15 минут. Водную фазу, около 700 мкл. переносим в чистую пробирку на 1,5 мл. РНК преципитируем добавлением 1-го объема 100% изопропанола и инкубацией при -20С, центрифугируем (10 мин. 10 тыс. g), супернатант удаляем. Осадок растворяем в 300 мкл. денатурирующего рабочего раствора и добавляем 1 объем 100% изопропанола. После 30 минутной инкубации при -20 С пробирку центрифугируем и супернатант удаляем. Осадок ресуспендируем в 75% этаноле, перемешиваем, инкубируем 10- 15 минут при комнатной температуре и центрифугируем 10 тыс. g 5 мин. Супернатант удаляем, осадок подсушиваем 5-10 мин и ресуспендируем в 15 мкл. DEPC-Н2О. Материал храним при -70 С.

Консенсусные праймеры Р1 и Р2 выделяют регион пестивирусного генома ЕО (826 п.н.) который максимально гомологичен у 3-х пестивирусов (ВД-КРС 1-го и 2-го типов и BDV) и не имеет гомологии с другими регионами пестивирусных геномов (11). На этой последовательность гибридизируются 3 типоспецифических праймера ТS1, TS2 и T3. Длинна амплифицируемой ДНК для Т праймеров была следующей: TS1 (566), TS2 (488), TS3 (223). Консенсусные праймеры ПЦР P1/Р2 амплифицируют регион длинной 826 п.н. Во второй реакции вложенной ПЦР полученный ПЦР продукт реагировал с ТS1,TS2,TS3 и Р2. ТS1/P2 продукт был специфичен для BDV, TS2/Р2 для ВД-КРС тип 2 и TS3/Р2 для ВД-КРС тип 1. Компоненты ПЦР кита, время, температурные режимы использовались в соответствии с наставлением. Реагенты включали вирус транскриптазу вируса лейкемии (Mul V) 50 ЕД/мкл., ингибитор РНК-азы 20 ед/мкл, ДНК по

лимеразу (5 мкг/мл), 10 мМ каждой dATP, dCTP, dGTP и dTTP и 10х ПЦР буфер II (500 мМ КСl, 100mM трис НCl pH8,3 в 25 мМ растворе MgCl2). Для постановки ОТ в пробирки вносили 20 мкл реакционной смеси содержащей: 4мкл. 25 мМ МgCl2, 2 мкл 10х ПЦР буфера, 2 мкл DEPC H2O (деионизированной), 2 мкл каждого dGTP, dCTP, dTTP, dATP, 1 мкл ингибитора РНКазы, 1 мкл МulV обратной транскриптазы, 1 мкл образца, 1 мкл Р2. ОТ проводили при 42С 15 мин. после начальной денатурации (99С 5 мин.) и затем охлаждение 5С 5 мин. Затем в пробирку добавляли следующие компоненты: 4 мкл 25 мМ раствора МgCl2, 8 мкл 10х ПЦР буфера II, 65,5 мкл DEPC DI H2O, 0,5 мкл ДНК полимеразы, 1 мкл Р1 и 20 мкл ОТ-реакционной смеси до общего объема 100 мкл. Начальный этап реакции длился 105 сек при 95С. 35 циклов проходили при 95С 15 сек и 60С 30 сек. Заключительный этап 72С 5 мин. Продукт хранили при 4С и анализировали после электрофореза в 2% геле агарозы.

Сравнивали между собой генотипы (1 и 2 типы), биотипы (СP и NCP). Для каждой представленной категории применяли биноминальный тест, переформируя в тест нулевой гипотезы в котором соотношение сp и образцов было эквивалентно 0,5. Этот тест повторяли для тестирования нулевой гипотезы где пропорция 1-го типа эквивалентна 0,5.

При проведении ПЦР 60 проб из 103 дали полосы консенсусного ПЦР продукта. Тем не менее, все 103 образца дали полоски типоспецифического ПЦР-продукта. 2 образца давали полосы, как 1-го типа, так и 2-го типа, ВД-КРС. Так, ПЦР-анализом было выявлено 105 ВД-КРС позитивных объектов (Табл.2). Из 105 образцов ВД-КРС 26 были 1-го типа цитопатогенного штамма (24,8%), 38 отнесены к 1 типу нецитопатогенного штамма (36,2%), 10 были 2 типа СР штамма (9,5%) и 31 - 2-го типа нецитопатогенного штамма (29,5%). NCP биотип изолировали чаще (65,7), чем СР, и 1-й тип генотипа чаще (61%), чем 2-й. BDV - 3 тип пестивирусов

Вся выборка для исследований OADDL включала несколько клинических состояний, в т.ч. диспансерное обследование на ВД-КРС инфекцию скота, животных с единичными и множестваенными органическими поражениями, павших и вынужденно убитых животных, и абортирававших животных. NCP-биотипы встречались чаще при скрининге стад. Этот биотип также преимущественно встречался при респираторных заболеваниях сопровождающихся фибринозной пневмонией. 1-тип встречался чаще у скота с энтероколитами без системных повреждений. СР-встречался преимущественно у скота с энтероколитами и системными повреждениями. СР биотипы также изолировали из образцов сыворотки.

Пат. вскрытия. 32 изолята были получены от трупов (табл.3). Они включали 15 штаммов 1 го типа СР, 9 NCP 1 типа, 2 СP 2 типа, 6 NCP 2 типа. Среди всех этих случаев 1-го генотипа было больше, чем 2-го (Р< 0,05). Статистически явные различия между генотипами и биотипами были выявлены для нескольких органов и систем. Значительно чаще генотип 1 го типа, выявляли при фибринозной пневмонии (Р<0,05). Скот с энтеро-колитом без системных повреждений чаще имел 1-й тип чем 2-й (P<0,05). Скот с энтероколитом и системными повреждениями, такими как язвы пищеварительного тракта и некрозы лимфатической ткани чаще имел CP биотип, чем NCP (P<0,05). При проведении исследований у одного животного были обнаружены геморрагические поражения (пневмония), у него изолировали NCP штамм 2-го типа. Все 4 ВД-КРС изолята от фетальных тканей были нецитопатогенными.

Вакцинальные истории были получены путем обзора регистрируемых данных. 54 образца были получены от вакцинированного скота. В нескольких случаях данные о вакцинации и типе вакцины отсутствовали. Наличие взаимосвязи между вакцинным штаммом и выделяемыми изолятами, установить не удалось. В вакцинированной группе изолировали как цитопатогенные так и нецитопатогенные штаммы, 1-го и 2-го типа. 5 образцов было получено от животных провакцинированных живой аттенуированной вакциной. От телят 30-90 дней после вакцинации было изолированно 3 цитопатогенных штаммов 1-го типа, 1 штамм 1-го типа нецитопатогенного биотипа от теленка спустя 17 дней после вакцинации, и 1 штамм 2-го типа нецитопатогенного биотипа от теленка в 4 дня после вакцинации. 4 образца были от телят привитых инактивированной вакциной. 1 CP штамм 1-го типа от теленка 150 дней после вакцинации, 1 NCP штамм 1-го типа ,был получен от теленка с неизвестными вакцинальными даннными, 1 NCP штамм 2 типа был от теленка спустя 14 дней после вакцинации и 1 СР штамм 2-го типа был от теленка с неизвестными вакцинальными данными. 5 образцов были от телят у которых не был зарегистрирован тип вакцины. 3 СЗ штамма 1-го типа были от телят 32-131 дней после вакцинации, 1 NCP штамм 1 типа - от теленка 14 дней после вакцинации, и 1 NCP штамм 1-го типа от теленка с неизвестными вакцинальными данными.

Из 105 образцов ВД-КРС было выявленно большее число нецитопатогенных биотипов и генотипов 1 типа, чем цитопатогенных биотипов и генотипов 2 типа. В этой работе впервые показанно присутствие обоих геноипов, 1-го и 2-го типа среди изолятов ВД-КРС. Недавно в Канаде стало наблюдатся увеличение частоты случаев ВД-КРС среди скота (4). Использование тестов на основе ПЦР или моноклональных антител позволяеет выявить присутствие 2-х генотипов ВД-КРС с антигенными различиями между собой (7,9). Более ранние исследования базировались на раздедении ВД-КРС на цитопатогенный и нецитопатогенный биотипы. Например, изучение изоляции вируса ВД-КРС диагностическими лабораториями с 1989 по 1995 годы выявило разброс встречаемости NCP от 66,1% до 87,7% в сравнении с 12,3%-33,9% CР штаммов (4). В нашем исследовании NCP биотип изолировали чаще (65,7%), чем СР. 95,3% образцов из Канады были 2-го типа (ранние исследования). Типирование ВД-КРС методом ПЦР, дает дополнительную информацию об эпидемиологии этого вируса среди КРС и, в частности о встречаемости его генотипов/биотипов в лабораторной практике. Частота генотипов/биотипов может увеличиватся за счет увеличения поражаемости органов или систем. NCP биотипы и генотипы 1-го типа больше встречались у скота с респираторными заболеваниями. Также, скот с патологоанатомическими признаками фибринозной пневмонии имел преимущественно 1 генотип. Интересно что, скот с патологоанатомическими признаками энтерита/колита (с системными повреждениями), перимущественно имел СР штаммы. Такие различия должно быть связанны с тем, что