ИММУНОГИСТОХИМИЯ.

СПИСОК РЕАКТИВОВ:

1) 0,01М фосфатный буфер (PBS).

2) Бычий сывороточный альбумин BSA

3) Растворитель: 1% BSA в PBS.

4) Ксилол.

5) Абсолютный спирт.

6) 0,1 трипсин в PBS или 0,1% протеаза.

8) Субстрат пероксидазы 3-амино9-этилкарбазол

9) Диметилформамид

10) 0,05М ацетатный буфер рН 5,0

11) Нормальная козья сыворотка.

12) Первичные антитела (кроличьи или мышинные) титр 20-100ul/ml

13) Вторичные антитела (анти-кроличьи или анти-мышинные) биотинизированные рабочее разведение 1:15-1:20.

14) Комплекс авидмн-перксидаза титр 1:15-1:20.

МЕТОД:

Срезы депарафинировать и довести до воды.

Для выявления антигенов в фиксированном формалином материале, их необходимо предварительно демаскировать инкубируя ткань с трипсином или притеазой.

1. поместить срезы на гладкую ровную поверхность . Не позволять им сопррикасатся друг с другом и высыхать.

2. Добавить несколько капель перекиси на срезы полностью их покрыв

3. Инкубировать при комнатной температуре 5 минут (для ингибирования эндогенной пероксидазы)

4. Прополаскать с PBS

5. Поместить в ванночку с буфером на 2 миниты.

6. Позволить срезам подсохнуть и убрать влагу вокруг них.

7. Развести первичные антитела или негативный контроль в их оптималььной концентрации в PBS c 1% BSA. Растворитель можно использовать как негативный контроль. Позитивный контроль-ткань заведомо имеющая изачаемыее антитела

Нанести реагент покрыв срез.

8. Наклонить срезы в двух разных направлениях.

9. Проинкубировать во влажной камере прри комнатной температуре 60 минут.

10. Осторожно прополоскать в ванночке с PBS 5 мин.

11. Дать срезам немного подсохнуть стрясти жидкость вытереть ее по краям.

12. Развести биотинизированные антимышинные антитела с PBS солержащем 1%BSA . Для элиминации неспецифического связывания антител можно развести антитела в PBS содержащем 5% нормальной козьей сыворотки если ткань человеческого происхождения подойдет 4% нормальная человеческая сыворотка.

13. Нанести сыворотку на срезы палностью их покрыв.

14. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре во влажной среде.

15. Осторожно пропаласкать в буфере.

16. Поместить в буфер на 5 минут.

17. Стряхнуть влагу, осторожно обтерть влагу вокруг срезов, поодсушить срезы.

18. Развести авидин-пероксидазу в оптимальноой концентрации.

20. Наклонить срез в 2-х разных направлениях.

21. Инкубировать 30 минут при комнатной температуре во вллажной камере.

22 Осторожжно прополаскать с PBS.

23. Поместить в PBS на 5 минут (продолжая помешивать).

24. Подготовка субстрата в течение финального промывания проводится следующим образом:

а) прготовить АЕС растворив 1 таблетку в 2,5 мл. диметилформамида этот раствор стабилен при комнатной температуре. Для удлиннения сохранности раствор хранят при 4 С.

в) смешать 0,2 мл раствора с 3,8мл 0,05М ацетатного ббуфера рН 5,0. Непосредственно перед использованием добавить 20 ul 3% Н202 . В результате раствор желтеет, он стабилен при комнатной температуре 2-3 часа. После этогго периода времени он не используется. По желанию смесь может быть профильтрована.

25. Подсушить срез, убрать влагу.

26. Нанести раствор субстрата 100ul покрыв срез ткани.

27. Игкубировать 5-10 минут или проводить реакцию под контролем микроскопа.

28. Окончить реакцию осторожно прополаскав в воде.

29. Докрасить ядра гематоксилином Майера (не использовать спиртосодержащие жидкости т.к. субстрат растворяется в органических красителях).

30. Заключить срезы в глицерин-желатину.