УДК 579.252.55:615.332:579.25:577.212.3
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В ДИАГНОСТИКЕ
FUSOBACTERIUM NECROPHORUM
В.И. Семенихин, А.А. Самоловов, Н.В.Некрасова
ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока
Некробактериоз - широко распространенное инфекционное заболевание, свойственное всем видам домашних и диких животных и птиц и проявляющееся гнойно-некротическим поражением различных тканей (кожа, слизистые оболочки, копыта, абсцессы внутренних органов) под воздействием Fusobacterium ne
crophorum. Некробактериозом может заболевать и человек [1].У F. necrophorum различают 3 основных (А, В и С) и 1 промежуточный биотип (АВ). Биотип А F. necrophorum subsp. necrophorum обычно выделяют из абсцессов печени крупного рогатого скота. Биотип АВ в основном находят в поражениях конечностей овец и крупного рогатого скота, биотип В F. necrophorum subsp. fundiliforme постоянно выделяют из содержимого рубца, а также из поражений, первично вызванных биотипами А и АВ. Биотип С выделен в новый вид
F. pseudonecrophorum, его можно установить в содержимом абсцессов и фекалий [2,3,4].Ущерб, причиняемый некробактериозом, весьма значительный. Он складывается из потери продуктивности животных, падежа, вынужденного убоя, абортов, расходов на лечение, затрат на наложение карантинов [5,6,7].
Борьба с некробактериозом до сих пор не увенчалась успехом. В связи с этим очень важно знать как этиологию, патогенез, так и другие аспекты данной инфекции, с тем, чтобы эффективнее проводить мероприятия, направленные на профилактику и ликвидацию этой болезни. Для профилактики, и особенно для ликвидации некробактериоза, первостепенное значение имеет своевременный и достоверный диагноз.
Основным способом лабораторной диагностики некробактериоза крупного рогатого скота в настоящее время является бактериологическое исследование (микроскопия мазка, посев на питательные среды, биопроба на лабораторных животных) [8].
Этот метод диагностики имеет свои минусы. Так, из очагов поражения, наряду с F. necrophorum, обладающих вирулентностью (биотипы А, АВ, В), выделяют не вирулентный биотип С, находящийся в рубце, и атипичные формы F. pseudonecrophorum, которые никогда не вызывают заболевание. По морфологическим и биохимическим признакам все биотипы очень схожи. Одновременно в больших количествах выделяется сопутствующая микрофлора: стафилококки, стрептококки, микрококки, картофельная, кишечная палочки и другие микроорганизмы. Поэтому выделить возбудителя заболевания сложно. При постановке биопробы выяснили, что лабораторные животные (кролики, белые мыши), наряду с возбудителем некробактериоза, также чувствительны и к сопутствующей микрофлоре. В целом на постановку диагноза затрачивается 12-16 суток. В случае значительного обсеменения биологических образцов вульгарной микрофлорой это время увеличивается на 6-10 дней.
В последние годы наиболее чувствительными и специфичными признаны методы, основанные на выявлении фрагментов генома возбудителя в биологическом материале с помощью молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции. Необходимо отметить, что эти
методы позволяют обнаружить концентрацию возбудителя в десятки раз меньшую, чем при традиционном бактериологическом исследовании. Это часто приобретает определяющее значение при постановке диагноза, так как в пораженном участке находится ассоциация микроорганизмов, а непосредственно возбудитель заболевания F. necrohorum находится в небольшом количестве. Также важно отметить, что методы, основанные на выявлении фрагментов генома возбудителя в исследуемом материале, позволяют сократить сроки диагностических исследований до 1-2 дней.Дифференциация патогенных и непатогенных штаммов F. necrophorum основана на фенотипических проявлениях генетической информации, заложенной в генах возбудителя и заключается в способности некоторых биотипов агглютинировать или лизировать эритроциты, синтезировать липазу. Главный фактор вирулентности возбудителя биотипов А, B и АВ - секретируемый бактериями лейкотоксин большого молекулярного веса, проявляющий активность против гранулоцитов
. Ген лейкотоксина представлен открытой рамкой считывания и состоит из 9726 нп. и кодирует белок в 3241 аминокислоту. Лейкотоксин не имеет подобия в последовательности с любыми другими бактериальными токсинами. Наряду с этим следует отметить, что принадлежность вирулентных штаммов F.necrophorum к одному или другому биотипу не связана с видом животного, у которого выявлен возбудитель заболевания [9-11].Цель нашей работы - разработать диагностическую тест-систему, основанную на полимеразной цепной реакции с гнездовыми праймерами, выявляющую патогенные штаммы F. necrophorum.
Нами был сконструирован опытный образец диагностической тест-системы по выявлению хромосомной ДНК вирулентных штаммов F.necrophorum с помощью специфических олигонуклеотидных праймеров в
гнездовой полимеразной цепной реакции. Для исследования были забраны биологические образцы от коров с пораженными конечностями. Результаты проведенных экспериментов показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получали только тогда, когда в качестве матрицы использовали ДНК возбудителя некробактериоза. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий (стафилококк, стрептококк, кишечная, сенная палочки, протей). Чувствительность предлагаемого способа выявления хромосомной ДНК F. necrophorum достаточно высока и составляет 1 пг.Литература:
1. Самоловов А.А. Роль Fusobacterium necrophorum в патологии человека// Научное обеспечение ветеринарных проблем в животноводстве: Сб. науч. тр./ РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 2000.- С.154-159.
2. Hodgson A.L.M., Nicholson L.A., Doran T.J., Corner L.A. Restriction fragment length polymorphism analysis of Fusobacterium necrophorum using a novel repeat DNA sequence and a 16S rRNA gene probe//FEMS Microbiol. Lett. - 1993.- V.108.- P.205-210.
3. Nicholson L.A., Moppow C.J., Corner L.A. et al. Phylogenetic relationship of Fusobacterium necrophorum A, AB, and B biotypes based upon 16S rRNA gene sequence analysis// Int. J. Svst. Bacteriol. - 1994.- V.44.- №2.- P.315-319.
4. Okwumabua O.G.I., Tan Z., Staats J. et al. Ribotyping To Differentiate Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum and
F.necrophorum subsp. funduliforme isolated from Bovine Rumminal Contents and Liver Abscesses//Appl. Environ. Microbiol. - 1996.-V.62.- №2.
- P.469-472.5. Коваленко Я.Р. Анаэробные инфекции сельскохозяйственных животных. М.: Сельхозгиз, 1954.- С. 167-222.
6. Максимович В.В., Веремей Э.И. Некробактериоз сельскохозяйственных животных/ Материалы к Республиканскому семинару вет. специалистов по проблеме некробактериоза.- Мозырь, 1999.- 56с.
7. Бондарько Д.Н. Этиология, патогенез, лечение и профилактика гнойно-некротических заболеваний пальцев у крупного и мелкого рогатого скота// Вопросы методологии и методики научных исследований по сельскому хозяйству.- Новосибирск, 1972.- вып.2.- с.158-159.
8. Методические указания по лабораторной диагностике некробактериоза. Утвер. ГУВ Госагропрома СССР 1 июня 1987/ А.А. Самоловов.- М.-1987.
9. Emery D.L., Vaughan J.A., Clark B.L. et al. Cultural characteristics and virulence of strains of Fusobacterium necrophorum isolated from the feet of cattle and sheep//Aust. Vet. J. -1985.- V.62.-P.43-46.
10. Shinjo T., Hiraiwa K. and Miyazato S. Recognition of biovar C of Fusobacterium necrophorum Moore and Holdeman as Fusobacterium pseudonecrophorum sp. nov.,nom,rev // Int. Syst. Bacteriol.- 1990.- V.40.- P.71-73.
11. Shinjo T., Fujisawa T. and Mitsuoka T. Proposal of two subspecies of Fusobacterium necrophorum Moore and Holdeman: Fusobacterium necrophorum subps. necrophorum subps. nov.,nom, rev and Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme subps. nov., nom, rev//Int. Syst. Bacteriol.- 1991.- V.41.- P.395-397.