Применение ПЦР для детекции BVDV (ВД) инфекции у крупного рогатого скота.
B.J.L. Hooft van Iddenkinge, P.A.van Rijn and R.J. Moormann.
Мы разработали ПЦР-тест для выявления инфекции BД у крупного рогатого скота. В этой работе были обследованны 112 голов КРС, 25 из них были позитивными на ВД, как в ПЦР,так и при изоляции вируса.
1.Введение.
Возбудитель вирусной диареи КРС (ВД) вместе с вирусом холеры свиней (HCV) и бордер-вирусной болезни (вирус классической лихорадки свиней (BDV) ) принадлежит к роду пестивирусов, семейства Flaviviridae (Wengler 19991). Вирус содержит плюс цепь РНК.(Diderholn, Dinter 1966)
Цитопатогенный (ср) и нецитопатогенный (ncр) биотипы ВД могут быть выделенны от скота пораженного болезнями слизистых оболочек (McClukin et al.1985, Howard et al. 1987.,). В основном вируснейтрализующие антитела, различающие как тот, так и другой
биотипы, отсутствуют, это показывает, что оба биотпа, выделенные от одной коровы, очень сходны по антигенам (Westernlink et al 1985).Постнатальня инфекция скота с ВД в основном остается в остается в субклинической или транзитной форме. У этих животных вырабатываются нейтрализующие антитела, и они выздоравливают (Malmquist 1968). Тем не менее, инфицированный скот может в течении 4-х месяцев рождать зараженных через гениталии телят, что не сопровождается образованием антител к ВД (McClurkin et al. 1984) Когда такой теленок, имеющий персистентную виремию,становится иммунотолерантным переносчиком ВД и инфицируется ср биотипом ВД, может развится болезнь слизистых (Brownline et al. 1984; Roederand, Drew 1984; Bolin et al.1985 a,b).
Переносчики становятся источником распространения вируса. Поэтому контроль за ВД-вирусом должен начинатся с выявления этого скота.
Носители выявляются определением вирусной инвекции в 2-х разных образцах крови в интервале 3 недели с титрацией образцовсыворотки или лейкоцитарных фракций в культуре клеток. Вирус выявляется пероксидазой связанной с моноклональными антителами (IРМА) или иммунофлуоресцентным тестом (IFT) (Wenvoort et al.1986;Straver et al.1983) Эти процедуры могут быть также нечувствительны для определения очень низких уровней инфицирующего вируса, в частности у скота имеющего специфические материнские антитела.
В этой статье мы описываем применение ПЦР (Saiki et al.1985) для детекции РНК вируса ВД у иммунотолерантных носителей. Мы выделили олигонуклеотидный праймер от участка генома кодируемого р80 (Collett et al.1988a,b). Потому что р80 наиьолее консервативная последовательность пестивируса (Moormaun et al. 1990
). Мы также выделили олигонуклеотидный праймер от 5" некодирующегого региона (5" NCR), который высоко консервативен среди 2-х видов ВД (NADL и Scloss) и 2-х HCV (Brescia et Alfort, Collett etal.1988a; Meiers et al.1990). Мы показали, что эти праймеры пригодны для ферментативной амплификации кДНК полученного от РНК ряда вариантов пестивирусов, включая полевые штаммы ВД.
2.Материал и методы.
2.1 Клетки и вирус.
Клетки теленка Madin Darbi (МDBK), полученные из национальной лаборатории ветеринарных услуг Амес IA, USA, клетки фетального бычъего эпителия FBE (P.J. Straver 1985), клетки детенышей свиньи SK6 (Kasza et al.1972) и РК15 выращиваемые в среде Эрла (MDBK и FBE) или основной среде Игла (SK6 и PK15) с 5% бычъей сывороткой плода (FBS), глутамином 0,3мг/мл и антибиотиками 200ед/мл пенициллина, 0,2 мг/мл стрептомицина и 100 ед/мл микостатина. Клетки были свободны от вируса, FBS была свободна от вируса и антител. BVDV и BDV и виды, идентификация которых была под
вопросом, выращивались на MDBK. HCV вирус выращивался на SK6 или
RK15 клетках.
2.2 Получение, процессинг и анализ проб крови.
Пробы крови от зорового скота и носителей ВД были получены Dr. P.J. Straver & Dr.A.Moerman, нашего института и Dr. J.J.Snoep,Dr. J.Verhoeff и Dr. G.N. Wentink региональных центров обеспечения здоровья животных в Zwolle, Gounda и Boxtel соответственно. Образцы крови 5-10 мл собранные, в пробирки содержащие ЭДТА,смешивались двумя объемами 0,83% аммония хлорида и инкубировались
при комнатной температуре 15 минут. Смесь центрифугировалась 10
мин. 200g и преципитат трехкратно промывался 50 мл фосфатного буферного раствора при комнатной температуре. Преципитаты затем ресуспендировались в среде Эрла. Ресуспендированные клетки замораживались при -70 С и оставлялись при комнатной температуре. Неочищенные лизаты или десятикратные серийные разведения лизатов в среде Эрла были смешанны с 50 мкл суспензии клеток MDBK (10 -10 кл/мл) в пластинах на 96 лунок, и инкубировались 4 дня при 37 С. ВД инфицитованные клетки визуализировались IPMA.
2.3 Препаровка.
РНК изолировалась из клеток инфицированных песивирусом или лейкоцитов с использованием лизиса и процедуры экстракции РНК описанной Chomczynski и Sacchi (1987). Клеточные монослои 25 см и преципитаты лейкоцитов препарированнные и отмытые как описанно выше, лизировались в 300мл раствора D (4М гуанидин изотиоционат, 25мМ натрия цитрат,0,5% саркозила и 0,1М 2 меркаптоэтанол) были добавленны 30 мл натрия ацетата рН 4, 150 мкл фенола (насыщенный водный раствор) и 60 мкл смеси хлороформ изоамиловый спирт (49:1), смесь перемешивалась 10 сек и охлаждалась на льду 15 мин. Смесь центрифегировалась 15 тыс.g, 20 мин, при 4С. Водная фаза переносилась в свободную пробирку, смешивалась с 1 мл 100% этанола, охлаждалась 30 мин. при -70 С
и центрифугировалась при 13 тыс. g 30 мин. -4С. РНК промывалось 300мкл 80% этанола, центрифугировалось 13 тыс.g 5 мин. при комнатной температуре, высушивалось под вакуумом, разводилось водой. Раствор РНК хранится при -70С.2.4 Олигонуклеотидные последовательности.
Олигонуклеотидные последовательности, использованные в этом исследовании показанны в таблице 1.
2.5 Полимеразная цепная реакция.
Обратная транскрипция осуществлялась в общем объеме 20 мкл:16 мкл воды содержащих 1мкг РНК выдерживались при 65С 10 мин, охлаждались на льду 5 мин, и смешивались с 2 мкл буфера обратной транскриптазы (500мМ Трис НСl рН 8,4, 50мМ MgCl2,50мМ дитиотреитол,500мМ KCl и 500 мкг/мл бычий сывороточный альбумин), 1 мкл 8мМ смеси нуклеотидов (2мМ каждого нуклеотида, Pharmacia),
0,5мкл праймер р169 или 147R (10мкМ) и 0,5 мкл обратной транскриптазы вируса лейкемии Молони (МLV)(200U/мkл,BRL).После 45 мин инкубации37 С, следует инкубация при 94 С 7 мин. Смесь охлаждалась на льду. Добавлялся 1 мкл РНКазы (100мкг/мл Pharmacia) инкубация продолжалась 30 мин при 37 С.
Реакция амплификации проводилась в общем объеме 100мкл, содержащем 21 мкл смеси с обратной транскриптазой, 10 мкл ПЦР-буфера (400мМ КСl, 20мМ МgCl2 и 200мкг/мл желатина), 10 мкл 8мМ смеси нуклеотидов (так же как и в обратной транскрипции), 5 мкл праймера (10мкМ каждого) р275/р169 или 180L/147R,0,4 мкл Таq полимеразы (5U/мкл, Perkin Elmtr Cetus Corp. USA) и воду. К образцам прибавляли по 2 капли минерального масла, подавляющего испарение. ПЦР осуществлялась в термоциклере. Каждый цикл амплификации состоял из денатурации 94С 1мин, отжига 60С 2 мин и синтеза 72С 4 мин. В каждом ПЦР анализе осуществлялось 40 циклов.
2,6 Гель электрофорез.
20 мкл ПЦР-продукта смешивались с 2 мкл STOP (25мМ ЭДТА рН 8, 0,5% додецилсульфата натрия, 0,05% бромфенолового голубого и 40% глицерола) и амплифицированная ДНК выявлялась электрофоретически на 1,5% агарозном геле в трис-ацетатном ЭДТА буфере содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия.
2,7 Гибридизация по Саузерну.
Саузерн-блотты были приготовленны как описывалось Самбруком (1989) с использованием генных мембран-экранов. Проба ДНК (125 нг) была связана 5^ концом с 25 мкС [гамма-32Р] АТФ и 5 ед по-
линуклеотидкиназы Т4 при 37С, на 2 ч , в конечном объеме 25 мкл.
Реакция была остановленна 5 мкл 0,2М ЭДТА и 32Р-связанная проба была очищенна на колонке сефадекса G50
Мембраны перед гибридизацией всю ночь находились при 50С в буфере содержащем 3хSSC (1xSSC-0,15M NaCl и 0,015М натрия цитрат), 5х денхардт (1х денхардт-0,02 фиколл 400, 0,02% поливинилпироллидон и 0,02% бычий сывороточный альбумин), 0,5% SDS, 0,05% пирофосфат натрия, 100 мкг/мл фрагментированного ДНК семени лосося и 20 мкг/мл тРНК. Затем мы добавляли не менее 10^5 cpm пробы в мл и блоты гибридизировались всю ночь при 50С. Мембраны промывались дважды в 3х SSC, 0,05% натрия пирофосвата, 0,1% SDS 5 мин при комнатной температуре и 1 раз 15 мин при 50С.
Авторадиография проводилась при комнатной температуре с пленкой кодак ХAR-5 0,5-48ч.
3. Результаты.
3.1 Лабораторная диагностика штаммов ВД.
Мы тестировали специфичность ПЦР-праймеров. ПЦР с обратной транскрипцией осуществлялось на РНК от 19 клонированных лабораторных штаммов пестивирусов (таб.2). Все тестируемые штаммы пестивирусов были выявленны в ПЦР с праймером р275 и р169. Однако использование для ПЦР анализа ВД праймеров 180L и 147R выявляло
только ВД и HCV штаммы, не было неспецифической амплификации продуктов когда были использованны РНК вирусов HCV и РНК неклассифисируемых пестивирусных штаммов. 84/9 и 5250.3.2
Диагностика ВД у носителей.Мы решили проанализировать 28 подозреваемых голов КРС из 6 различных ферм в Нидерландах. Кровь была собрана двухкратно и один образец испытывался на наличие вируса ВД в 2х RAHSCs. Трупный материал использовался для титрации вируса и ПЦР анализа в нашем институте. Результаты этих анализов суммированы в таблице
3. 24 из 28 являлись носителями вируса ВД, как показало выделение вируса от большого количества проб крови, взятых с интервалом не менее 3х недель, как необходимо для RAHSCs. Как установили в нашем институте 23 из этих носителей содержали вирус в крови. Титр вируса колебался от 10 в 2,20 степенни до 10 в 4,45 ТСID 50.Мы не смогли выделить инфицирующий вирус от одного носителя. Использование ПЦР анализа показало содержание РНК вируса ВД в крови.
Хотя корова 995 была носителем ВД по RASHCs, мы не выявили инфицирующего вируса ВД в ее лейкоцитах. ПЦР анализ тем не менее показал присутствие РНК ВД в крови этой коровы.
Мы не смогли по RASHC определить ВД в крови коровы R 5266-1. Однако ПЦР-анализ продемонстрировал присутствие РНК ВД. Мы также одно стадо КРС (84 головы) на ВД используя ПЦР анализ (результаты не показанны). Мы выявили только одну корову которая содержала РНК ВД в ее лейкоцитах. Эта корова была также единственной, которая содержала инфицирующий вирус ВД определяемый RAHSC.
4. Обсуждение.
Диагностическая техника, использующая ПЦР, была разработана для определения ВД в лей коцитах от носителей вируса. Олигонуклеотидные праймеры были выбраны в некодирующем регионе р80 ср штамма NADL, наиболее консервативном среди других штаммов ВД.
Действительно, все другие протестированные лабораторные штаммы ВД были выявленны с ПЦР праймерами р80, выявляющих тесную взаимосвязь между BDV и BVDV на уровне нуклеиновых кислот. Более того штамм BD-112, который был изолирован от овцы и классифицирован как ВDV (Terpstra 1978), мы переклассифицировали в одну серологическую группу как штамм орегон ВД. Вдальнейшем на основе результатов ПЦР 2 штамма пестивируса 84/9 и 5250 не могли быть классифицированны как ВД. ПЦР-анализ с 5^ NCR праймером показал что вся РНК тестируемых изолятов содержит РНК специфичную для пестивирусов.
Как показало выявление РНК ВД в лейкоцитах 25 подозреваемых на ВД носителей, родом из 7 различных ферм, наши праймеры также обеспечивают выявление (ncp) полевых штаммов ВД. Все 25 ВД носителей были позитивны не только по изоляции вируса, но так же и с ПЦР.
Одна корова (995) была содержащей инвекционный вирус ВД в ее лейкоцитах, как определено по RAHSC и ПЦР в нашем институте. Однако мы не смогли определить вирус в лейкоцитах от этой коровы. Это возможно результат инактивации инфекционного вируса в крови. Потому что прошло 4 дня между получением крови от коров 995-998 и доставкой ее в наш институт. Во всех других случаях, этот период был около 1 дня. Тем не менее определение РНК ВД показало, что корова 995 действительно была носителем ВД.
Неинфекционный вирус ВД был выделен из крови от коровы R 5266-1. Однако ПЦР-анализ установил присутствие РНК ВД в лейкоцитах этой коровы, и позднее, в крови были выявлены антитела против вируса ВД (результаты не опубликованны). Эти находки показывают, что корова R 5266-1 была постнатально инфицированна ВД. Действи- РНК ВД не выявлялось в крови этой коровы (результаты не показанны
).Выше приведенные данные показывают, что метод ПЦР является более чувствительным в диагностике ВД, чем выделение вируса. Действительно, как покзывает Hoof van Iddeking et al. (1992), ПЦР-анализ в 10 раз более чувствителен, при диагностике ВД, чем выращивание вируса. Мы заключили, что техника ПЦР может обеспечить ценную альтернативу технике выделения вирусов ВД из лейкоцитов зараженного скота и ценный тест для подтверждения результатов вирусной изоляции. Однако, ни ПЦР, ни выделение вируса не могут выявить различия между постнатально-инфицированным скотом,имеющим still-виремию, и носителем ВД. Далее, второй анализ (не менее 3 недель после первого) в сочетании серологическим анализом на ВД
нейтрализующие антитела (против ВД выделенного от нескольких коров), должен выявить освобождение носителей. Лучшая стратегия выявления носителей- в анализе сывороток всего вируспозитивного скота на ВД нейтрализующие антитела. Только скот без таких антиател должен быть тестирован во второй раз. Изучение этого скота может показать острую постнатальную ВД инфекцию. Конечно эта стратегия может быть применена только когда материнские антитела исчезнут.