ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока.

Болезнь слизистых оболочек, известная также как вирусная диарея крупного рогатого скота (ВД КРС), является вирусным заболеванием, встречающимся среди всех парнокопытных животных (Dufell S.J., Harkness J.W. 1985). Заболевание протекает с развитием респираторного или диарейного синдрома. В патогенезе этой болезни характерным моментом является блокирование иммунореактивности организма в следствие поражения иммунокомпетентных клеток. (Roth J.A.,Kaeberie M.L. 1983). Иммунодепрессивное деиствие вируса вызывает трудности в серологической диагностике вирусной диареи, в то же время частые случаи персистентной инфекции, наличие нецитопатогенных штаммов, затрудняют выяснение роли вируса в конкретной эпизоотической ситуации. Поэтому, сегодня зонды не потеряли своей актуальности.

Проведение молекулярной гибридизации in situ (в гистосрезах или мазках) не только позволяет идентифицировать вирус, но и показать в каких клетках он репродуцируется, с какой интенсивностью, как это связанно с, имеющим место, патологическим процессом и т.д.

С целью изучения специфичности и чувствительности, а также отработки методики, зонд гибридизировали с ДНК и РНК различных вирусов и бактерий с пробами РНК полученными из проб селезенок и крови крупного рогатого скота и предварительно исследованными в ОТ-ПЦР на вирусную диарею, а также, с ПЦР-продуктами.

Краткое описание стадий анализа

1. Выделение РНК из проб от животных.

Из исследуемого образца выделяют РНК гуанидин-фенол-хлороформным методом.

2. Нанесение образцов РНК на фильтры для гибридизации.

Выделенную РНК фиксируют на капроновом мембранном фильтре УФЛ (2 мин.).

3. Гибридизация образцов РНК с биотинилированным ДНК зондом.

Фильтры с фиксированной РНК инкубируют в гибридизационном растворе содержащем биотинилированный ДНК-зонд и 10% формамида, при температуре 58,8^оС. в течение 3 часов.

4. Выявление биотиновых групп на фильтре с помощью коньюгата стрептавидина с щелочной фосфатазой и красителей.

Фильтр после гибридизации отмывают от избытка зонда и инкубируют с коньюгатом стрептавидин-щелочная фосфатаза.. Образовавшийся комплекс биотин-стрептавидин-щелочная фосфатаза выявляют на фильтре с помощью твердофазных красителей-субстрата щелочной фосфатазы 5-бром 3-индолил-фосвата и нитротетразолевого синего. В местах нанесения образцов, содержащих вирусную РНК, появляются сине-фиолетовые пятна.

Результаты исследований.

Полученный ДНК зонд гибридизировался: с мРНК 2-х референтных штаммов вируса вирусной диареи (Оregon C24 и ВК-1 (ВИЭВ)), РНК выделенной из селезенок серопозитивных в РН животных, также положительных в ОТ-ПЦР. Обработка РНК ферментом РНКазой предотвращала появление гибридизационного сигнала, что свидетельствует об участии РНК в гибридизации. Для подтверждения специфичности реакции были поставлены отрицательные контроли с ДНК: аденовируса, вируса герпеса 1-го типа, 2-х штаммов E.Coli, 4-х видов рода Mycoplasma, полевых изолятов микроорганизмов родов Streptococcus, Staphilococcus, Fusobacterium, Proteus, хромосомной ДНК кролика и коровы, РНК из проб селезенки крупного рогатого скота отрицательного при исследовании методом ОТ-ПЦР и серонегативного при исследовании сыворотки крови с помощью реакции нейтрализации. Во всех случаях, реакция была отрицательной.

Оценка чувствительности реакции была произведена путем нанесения десятикратных разведений РНК вируса вирусной диареи (см. табл.2). Чувствительность была наибольшей при использовании ПЦР-зонда разведенного в 500 раз. Дальнейшее увеличение концентрации зонда приводит к повышению фоновой окраски.

Любой гибридизационный эксперимент сопровождался постановкой отрицательных контролей, благодаря чему можно подтвердить воспроизводимость и стабильность реакции.

Таблица 1 изучение специфичности Нозерн-блот-гибридизации

Таблица 2. оценка чувствительности Нозерн-блот-гибридизации.

Примечание: + положительная реакция, - отрицательная реакция.

Выводы: амплифицированный и биотинилированный фрагмент генома вируса вирусной диареи крупного рогатого скота может быть использован в качестве ДНК-зонда в реакции Нозерн-блот-гибридизации.

Учитывая тот факт, что синтез нуклеиновых кислот идет в направлении DNA - RNA, можно сделать вывод - использование хромосомной DNA при оценке специфичности Нозерн-блот-гибридизации, дает гарантию отсутствия в клетках комплементарной зонду гетерогенной иРНК, при экспрессии любого хромосомного гена.

Наработанный с помощью ПЦР фрагмент был использован для Электрофорез рестрикционных фрагментов 4% полиакриламидном геле позволила установить размеры клонированного фрагмента, около 997 п.н. В качестве маркера моллекулярного веса использовалась плазмида рQpR рестриктированная НаеIII. Полученую рекомбинантную плазмиду подвергли мечению биотином в НПО Вектор.

С целью изучения специфичности и чувствительности полученного ДНК-зонда мы провели серию реакций моллекулярной гибридизации.

Фрагмент геномной РНК вируса вирусной диареи был амплифицирован в присутствии 1мМ Био-dUTP с целью дальнейшего получения биотинилированного зонда. (Молекулярная клиническая диагностика. Методы./ Под ред.С.Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир.)