Геном пестивируса состоит из положительной неполиаденилированной моллекуля РНК приблизительно 12,3 кб, которая содержит один большой, открытый для чтения фрагмент фланкируемый 5 и 3 некодируемыми регионами (NCR) (Becher et al 1998a, Colett et al

1988). В вирусном полипротеине, вирусные протеины разделяются на следующие (от С к N концу):N pro, C, Ems, E1, E2, p7, NS 2-3, (NS2), (NS3), NS4A, NS4B, NS5A и NS5B (обзор Meyers and Thill

1996). Аббревиатура N pro образованна от N-терминальной аутопротеазы; и E ms (рибонуклеаза растворимая) представляет структурный гликопротеид с рибонуклеазной активностью. Структурные белки представлены капсидным протеином С и 3-мя покровными белками (Еms, Е1 и Е2). Оставшиеся белки предположительно не структурные (NS).

Различные участки пестивирусных геномов явились объектом для изучения их генетических различий, включая различные части 5NCR также как гены кодирующие С, Е2, Npro и др. неструктурные белки. 4 вида пестивирусов BVDV-1, BVDV-2, BDV и CSFV могли быть дифференцированны сравнением полных последовательностей генов (Becher et al. 1998a) и частичным секвенированием (Becher et al 1995,1997). Короткие последвательности описанные для высококонсервативного 5 NCR могут быть использованы для разделения пестивирусов на существующие виды, но менее подходят для дальнейшего подразделения видов вирусов на первичные подгруппы. Напротив, гены кодирующие Npro и Е2 представляются полезной, достоверной мишенью для филогентического анализа пестивирусов (Becher et al.,1995, Tijssen et al 1996; van Rijnet et al 1997; Vilcec et al

1997).

Предварительные исследования разделили на генетические группы на ветвях филогенетического дерева. В добавление к этому методу сравнивалось сходство последовательностей. Одним из этапов этого исследования было определение уровня сходства последовательностей, чтобы соотнести его с категориями вида, подгруппы, штамма. Необходимость такого разграничения возникает когда исследуются новые пестивирусы. Эта работа связана с генетической гетерогенностью новых пестивирусов выделенных от домашних и диких жвачных видов. Пестивирусы от бонго, северного оленя и бизона характеризуются здесь впервые. Результаты нашего анализа первые в исследовании новых подгрупп внутри видов BVDV-1 и BVDV-2 и дают свидетельства о наличии дополнительно больших генетических групп внутри рода пестивирус.

Для характеризации новых изолятов пестивирусов мы остановили внимание на N pro кодирующем регионе генома. Для всех проб пестивирусов анализируемых РТ-ПЦР использовалась 1 пара праймеров, обеспечивающих амплификацию N pro гена вместе с 5 NCR и участком генома кодирующего С и часть Еms. После моллекулярного клонирования в бактериальный вектор, последовательность соответствующая кодирующему N pro участку определялась секвенированием обеих комплементарных цепей трех независимых клонов. Для всех пестивирусов, включая новые изоляты, присутствующие здесь, N pro ген образуют 504 нуклеотида. Эволюционные взаимосвязи N pro генов были оценены вилогенетическим анализом, использующим соседе-связывающий метод (Felsenstein 1985,1993). Дополнительно были включены опубликованные последовательности пестивирусных изолятов, отраженные в таблице 1.

pro генов и UPGMA имело идентичную топологию с деревом образованным соседе-связывающим методом (неопубликованные данные). Ветви дерева образованные на последовательностях аминокислот, были идентичны таковым, основанным на нуклеотидных последовательностях, но объем различий был слегка ниже (неопубликованные данные).

Разделение пестивирусов на простейшие генетические группы представляет важный критерий для их классификации. В предварительном филогенетическом анализе отдельные виды пестивирусов вместе с их подгруппами были размещены на ветвях филогенетического дерева. В добавление к этому методу, последовательности могли быть сравнены замером сходства парных последовательностей. Как бало предварительно установленно, одной целью данного исследования было определение рангов дивергентности последовательностей соотносившихся с категориями вида, подгруппы и изолята.

С этой целью были расчитаны парные эволюционные дистанции для N pro гена. В соответствии с пятью существующими видами пестивирусов, ранги дивергенции последовательностей были: <14,2% между вирусными изолятами одной подгруппы, 16,2-28,8% между подгруппами и 36,2-55,9% между видами. Согласно трем категориям вида, подгруппы, и изолята могли ясно различатся расчитываемые генетические дистанции. Тем не менее классификация изолятов северный олень-1 и бизон-1 проблематична. Дистанция между этими двумя изолятами и BDV была между 29,6% и 37,6% с расчитанной средней 34,0% лежащей в промежутке между ранее расчитанными рангами вида и подгруппы. Дивергенция между северный олень/бизон вирусом и другими видами пестивирусов была от 39,1 до 50,7%. Основыаясь на классификации северный олень/бизон вируса как подгруппы BDV, парные дистанции между подгруппами одного вида (подгрупповый ранг 16,2-37,6%) пересекаются с дистанцией между разными видами (видовой ранг 36,2-55,9%) (фиг.2а). Напротив северный олень/бизон вирус должен быть классифицирован как отдельный вид пестивирусов. Эти результаты четко разделяют ранги дистанций на три категории: изолят (<14,2%), подгруппа (16,2-28,8%) и вид (29,6-55,9%) (фиг.28). Объединенные вместе, результаты нашего анализа показывают, что северный олень/бизон изоляты представляют дополнительную, шестую, большую генетическую группу внутри рода пестивирус. Более того появившиеся окончательные категории различиу последо-

вательностей могут быть полезными для классификации новых пестивирусных изолятов.

Гликопротеин Е2 является одним из наиболее вариабельных протеинов пестивирусов, и этот регион использовался в предварительных исследованиях касающихся гетерогенности (Tijssen et al.,1996; van Rijn et al.,1997). Е2 ген постоянно представленый у пестивиру-

сов, покрывающий все виды и подгруппы идентифицируемые анализом N

pro региона, был клонирован и секвенирован при изучении вариабельности пестивирусов как второй участок генома. Тогда как N pro ген всех пестивирусов удачно амплифицировался в РТ-ПЦР с использованием одной пары праймеров (см. выше). Мы не ограничились одной парой праймеров для амплификации Е2 генов. Е2 гены штаммов пестивирусов 721, 519, С86, Gi1, Gi2, SCP, SH9, Deer-NZ1, Deer-GB1, Giraffe-1, Reindeer-1 и Bison-1 были амплифицированны РТ-ПЦР использующей первые праймеры (расположенные в регионе коди-

рующем Е1) и обратные праймеры (расположенные в регионе кодирующем р7 и NS2). Установленные последовательности сравнивались с опубликованными последовательностями других пестивирусных штаммов. Исследование аминокислотных последовательностей выявило 15 цистеиновых участков, которые сохраняются среди всех пестивирусов (неопубликованные данные). Два дополнительных цистеина в идентичной позиции в Е2 у всех штаммов пестивирусов жвачных, но не найдены в Е2 СSFV. Более того инсерции и делеции одной или двух аминокислот, наблюдаются в разных участках Е2. Изучая генетическую гетерогенность внутри Е2 региона, филогенетическое дерево было сформировано используя соседе-связывающий метод для нуклеотидных последовательностей кодирующихся внутри Е2. Топология дерева оснванная на Е2 была идентична была идентична такому же основанному на филогенетическом анализе N pro региона.

Статистический анализ дерева основанного на Е2 показал что все группируемые виды и подгруппы характеризовались достоверным отличием (Р<0,095). Филогенетическое дерево, основанное на анализе

аминокислотных последовательностей методами neighbor-joining,

UPGMA и Fitch-Margoliash методом, представляет более короткую структуру. Можно заключить, что разделение рода пестивирус на первичные виды и подгруппы, определяемое анализом N pro региона, подтверждается филогенетическим анализом Е2 региона.

Сравнение Е2 генов также показывает что пестивирусы от северного оленя/бизона могут быть группированы отдельно от всех других пестивирусов и они более сходны с BDV, чем с другими видами пестивирусов, такое же сходство обнаружено в N pro последовательностях. Для далнейшего анализа были расчитаны парные эволюционные дистанции для последовательностей кодирующих Е2. Когда пестивирусы северный олень/бизон классифицировались или как дополнительный новый вид или как подгруппа BDV, ранг дистанции Е2 между подгруппами был отдельным от дистанции между видами, но пересекался с дистанциями между изолятами (фиг. 8в и 3с). В соответствии с ранними анализами пестивирусов, наши группировки основанные на Е2 и N pro генах в основном соответствовали опубликованным другими. Тем не менее существует штамм Deer, дифференцировка которого затруднена. Благодаря сравнению аминокислотных последовательностей N хвоста Е2, он был представлен как отдельный генотип внутри рода пестивирус (van Rijn et al., 1997). Согласно нашему анализу N pro и Е2 регионов, штамм Deer явно относится к BVDV-1. Сравнение последовательностей Deer, определенного как Deer GB1, с опубликованной последовательностью штамма Deer, обнаружило только одно отличие аминокислот среди 110 аминокислот N конца Е2, короткий участок из 16 аминокислот имел 11 отличиу между этими двумя последовательностями, остальная часть из 52 аминокислот имеет 100% идентичность межу двумя последовательностями (фиг.4). С исключением последовательности опубликованной van Rijn и др. 1997, регион, включающий выше упомянутые различия, часто сохраняется среди 5 подгрупп BVDV-1 (фиг. 4). Объединенные вместе, результаты наших анализов четко показывают, что штамм Deer относится к BVDV-1 и не представляет отдельного генотипа пестивирусов.

В представленном исследовании 16 новых пестивирусных изолятов от различных видов хозяев, были охарактеризованны на моллекулярном уровне. Результаты нашего анализа выявили присутствие дополнительного вида пестивируса, представляющего изоляты от северного оленя и бизона. Дополнительная информация последовательностей, серологические исследования, эксперименты на животных и т.д. покажут, будет ли представлять актуальность этот вид вируса внутри рода пестивирус. Более того филогенетический анализ позволил идентифицировать новые подгруппы внутри BVDV-1 и BVDV-2. Остается определить являются ли подгруппы внутри видов связанными в разли-

чиях относящихся к вирулентности и перекрестному иммунитету. Это

было показано для двух различных серотипов BVDV-1 недавно, но

имеющиеся данные были основаны только на сыворотке против одного

вируса, использовалось очень ограниченное число изолятов BVDV

1995), изолят CSFV Schweinfurt (Kosmidou et al., 1995) и пестиви-

русы от оленя (Becher et al., 1997; Frolich and Hofmann, 1995) и

жирафа были описаны ранее. Вакцинные штаммы BVDV RIT 4350 (Becher

zer (Kalsruhe, Germani) и Intervet International (Boxmeer, the

Netherlands), соответственно. Все пестивирусные изоляты исследованные в этом исследовании помещены в таблицу 1 вместе с соответствующими им видами, годом выделения и регионом выделения. Штаммы BVDV RIT и C86, так же как изоляты 519, 871, 721, Gi-1, Giraffe-1 и SH-9 вызывают цитопатогенный эффект в культуре ткани, тогда как другие вирусы, отраженные в таблице 1, нецитопатогенны.

Tipe Culture Collection (Rockville, MD). Инфицирование клеток проводилось как описанно ранее (Becher et al., 1997). Клетки выращивались на среде Дюльббеко модифицированной Иглом содержащей 10% сыворотки лошади.

Клетки и среда регулярно тестировались на отсутствие пестивирусов РТ ПЦР и иммунофлуоресценцией с моноклонльными антителами

8.12.7 (полученными против NS3) благодаря E.J. Dubovi (Cornell Universiti, Ithaca)

1999), так же как античувствительные праймеры OI 35 A (Becher et al. 1994), и OI 1400 R (Becher et al 1997) были описаны ранее.

OI SCPЕ2, также как с праймером OI P4700R и праймером OI P3400. После амплификации продукты ПЦР были охарактеризованны геле агарозы-этидиум бромида в трис-ацетатном буфере.

Филогенетический анализ. Компьютерный анализ данных секвенирования был осуществлен с использованием HUSAR (DKFZ, Heidelberg, Germany), который обеспецивался пакетами GCG и PHYLIP. Выравнивание аминокислотных и нуклеотидных последовательностей производилось программами PELEUP и CLUSTAL. Филогенетическое дерево было сконструированно для Е2 и N pro генов так же как для соответствующих аминокислотных последовательностей с использованием neighbor-joining, UPGMA, maximum-likelihood методов. Эволюционные дистанции были определены с помощью двух параметрического метода Кимуры (Kimura, 1980)