Вирус вирусной диареи крупного рогатого скота (ВД КРС), вызывает заболевание протекаеющее с развитием респираторного или диарейного синдрома. Следует отметить, что метод вирусовыделения на культуре клеток обладает высокой трудоемкостью, не позволяет выявить нецитопатогенные штаммы, что затрудняет постановку диагноза - вирусная диарея.

Собственные исследования: На матрице геномной РНК вируса производился синтез кДНК с помощью реакции обратной транскрипции (ОТ). Перед постановкой реакции обратной транскрипции (ОТ) в объеме 12,5 мкл. готовили реакционную смесь: 5х ревертазный буфер для Тth-полимеразы 2,5мкл 2.5мМ; dNTP 1,3 мкл праймер ОТ №1 серии bvhc 5OU/ml 0,5 мкл; DEPC Н2О 5,2; мкл мRNA 2,5 мкл. Tth-полимераза 0,5мкл. После добавления РНК вируса вирусной диареи реакционная смесь инкубируется при 54 С в течение 30 мин. Перед постановкой полимеразной цепной реакции ПЦР в объеме 25 мкл. готовим реакционную смесь: 10х буфер для Таq-DNA-полимеразы 2,5мкл 2.5мМ; dNTP 2,0 мкл праймеры ПЦР№№ 24up и 35low серии bvhc 5OU/ml 2,5 мкл; Н2О 12,5 мкл; kDNA 5,0 мкл. 2,5 мкл Мечение рагмента осуществляется путем введения в реакционную смесь 1.0 мМ Био-dNTU 1,0 мкл. и проведения дополнительно 10 циклов ПЦР по той же программе.

Контроль технологии синтеза зонда производится путем электрофореза в 1% геле агарозы и выявление полосы соответствющей 450 п.н. – биотинилирования путем выявления биотиновых групп зонда нанесенного на блот с помощью коньюгата авидин-щелочная фосфатаза. Специфичность и чувствительность зонда контролируется путем проведения реакции моллекулярной гибридизации на мембранном фильтре с вирусной РНК штаммов Oregon C 24 и ВК 1 ВИЭВ а также с заведомо отрицательными контролями.

Заключение: получение и мечение последовательности зонда с помощью ОТ-ПЦР более перспективно по сравнению с традиционным методом клонирования в плазмидный метод и биотинилирования методом рассеянной затравки, или ник трансляции. ПЦР зонд не содержит векторных последовательностей, что повышает его специфичность, себестоимость изготовления намного ниже, чем при использовании традиционного метода.