Источник: Cell. Vol. 80. 371-378, February 10,1995

Авторы: Adrian Erlebacher, Ellen H. Filvaroff, Stephen E. Gitelman, and Rik Derynck.

К МОЛЕКУЛЯРНОМУ ПОНИМАНИЮ РАЗВИТИЯ СКЕЛЕТА.

Adrian Erlebacher, Ellen H. Filvaroff,

Stephen E. Gitelman, and Rik Derynck.

Много наших знаний о хряще и кости пришло от описательной анатомии, эндокринологии и клеточных исследований костного обмена. Недавние исследования позволили идентифицировать локальные факторы, которые регулируют морфогенез скелета. Моллекулярные и биохимические исследования клеток кости и хряща in vitro, инактивация генов умышей и генов ответственных за аномалии скелета человека и мыши зафиксировали важность специфических ростовых и дифференцировочных факторов, протеинов внеклеточного матрикса, сигнальных медиаторов и факторов транскрипции, в развитии кости и хряща. Явная конвергенция генетик мышей и человека в биологии скелета иллюстрирована в журнале Cell две статьи которого показывают, что мутация гена коллагена ХI типа-причина хондродисплазии как у cho/cho мыши, так и у пациентов со Stickler-синдромом (Li et al&1995.,Vikkula et al., 1995)

В основном, последние данные показывают необходимость отражать развитие скелета на разных интегрированных уровнях организма и иллюстрировать как продукты отдельного гена влияют на развитие на этих разных уровнях. Структура информации определяется не только планом тела раннего скелета, но также формой каждого индивидуального скелетного элемента. В добавок, во сяком случае последовательность течения роста кости должна контролироваться и по времени и локально для обеспечения правильных пропорций элементов тела. Позиционная информация может также регулировать основу внутренней структуры кости через рост, в то время как локальные гомеостатические механизмы должны поддерживать интеграцию кости в течение взрослой жизни. И наконец комплекс экстрацеллюлярного матрикса должен быть генерирован скелетными тканями со специфическими биомеханическими свойствами.

Несомненно морфогенез скелета происходит от регуляции дифференцировки, функций и взаимодействия этих компонентов с клеточными типами. Скелету присущи 3 главных клеточных типа: хондроциты-которые формируют хрящ, остеобласты-которые накапливают костный матрикс и остеокласты которые резорбируют кость. Хондроциты о остеобласты-мезенхимального происхождения, тогда как остеокласты происходят от гемопоэтической системы. Однажды появившись в костном матриксе, остеобласты созревают в окончательно дифференцированные остеоциты. Активность и диффенренциация остеокластов четко координируются как в течение развития формирующейся кости и в течении роста и зрелой жизни, так и в кости продолжающей подвергатся ремоделингу. Более специфичное формирование внутренней структуры кости и костный ремоделинг происходят от равновесия:

костной резорбции активированными остеокластами с последующим накоплением нового матрикса остеобластами (фиг1). Костный ремоделинг также связан с костным обменом эндокринного гомеостаза кальция и фосфора, с минерализацией костного матрикса как важного склада этих ионов в теле.

Описательная эмбриология и анатомия различает 2 типа развития кости. Интрамембранный и энхондральный. Интрамембранозная оссификация наблюдается когда мезенхимальные предшественники дифференцируются преимущественно в кость-формирующие остеобласты, процесс наблюдается при генерации плоских костей черепа также как и при добавлении новой кости

к внешней поверхности длинных костей. Напротив эндохондральное образование кости включает конверсию первичной хрящевой матрицы в кость и оно ответственно за образование большинства костей скелета. Хрящевые матрицы формируются в течение эмбриогенеза, когда мезенхимальные клетки конденсируются а затем дифференцируются в хондроциты. Эти клетки последовательно проходят программу гипертрофии, кальцификации и клеточной смерти. Наблюдается сопутствующая неоваскуляризация, остеокласты и остеобласты рекрутируются для размещения на хрящевых строительных лесах образуя костный матрикс и зрелую губчатую кость. Продольный рост кости осуществляется через структуру сходную с энхондральной оссификацией в ростовых пластинках, локализованных в эпифизах длинных трубчатых костей. В этих эпифизеальных пластинках кальцификация гипертрофического хряща обеспечивает строительные леса для формирования новой губчатой кости. Несомненно весь оставшийся хрящ замещается костью кроме хрящевых суставных поверхностей. (фиг2)

Структура скелета

Классическая эмбриология показала, что дерево отдельных эмбриональных возрастных линий закладывается в раннем скелете. Нервный гребешок дает жаберные дуги образующие черепно-лицевой скелет. Склеротомы производят большую часть осевого скелета и латеральная пластинка мезодермы формирует добавочный скелет. Трансплантационные исследования выявили, что информация относящаяся к числу анатомической идентичности образующихся элементов скелета, появляется уже к началу их образования и задолго перед окончанием скелетогенеза. Семейство факторов транскрипции, кодируемое гомеобокс генами , играет центральную роль в этом аспекте формирования структуры скелета (обзор Morgan and Tabin 1993; Krumlauf 1994). Специфические гомеобокс гены экспрессируются в отдельных структурах ко времени, когда начинают формироватся эмбриональные зачатки. Более того целевая инактивация или эктопическая экспрессия этих генов у мышей, приводит к уменьшению или прибавлению элементов скелета или к трансформации элементов скелета в формы похожие на другие элементы. Например hoxa-2 ген экспрессируется 4-м ромбомере нейроэпителия перед миграцией клеток нервного гребня и их последующей дифференцировкой в скелетные элементы второй жаберной дуги. Локализация его экспрессии сочетается с результатами трансплантационных экспериментов, показывающих, что этот ген требуется для детерминации тождества второй жаберной дуги. Соответственно, инактивация hoxa-2 гена приводит к делеции черепно-лицевых элементов происходящих от 1-й жаберной дуги (Gendron-Maquire et al 1993; Rijli et al 1993). Так, в отсутствие продуктов гена hoxa-2, у скелетогенного нервного гребня второй жаберной дуги отсутствует тождество с первой жаберной дугой. Те же самые принципы могут быть продемонстрированы с использованием hoxd 13 гомеобокс гена в качестве примера для осевого и добавочного скелета. hoxd-13 экспрессируется в пресомитической мезодерме последнего региона эмбриона перед формированием склеротома и встречается в мезодермальном зачатке скелета так же как в заднем дистальном регионе почки лимба. Инактивация hoxd-13 гена приводит к трансформации 4-го крестцового позвонка в кость похожую на 3-й и к ассортименту делеций или добавок скелетных элементов дистального лимба (Dolle et al; 1993).

В хорошо изученной системе развития лимба обнаружена дополнительная важность индукционных воздействий в регуляции структуры скелета. Сигналы существенные для структурирования лимба, исходят из зоны поляризационной активности (ZPA), которая локализуется в задней мезодерме лимба подлежащей под эктодермальным апикальным гребнем (АЕК) развивающейся почки лимба. Трансплантация ZPA под AEK на передний край другой почки лимба приводит к зеркальной дупликации элементов скелета, феномену который также наблюдается когда ретиновую кислоту наносят на те же самые передние участки. Секреторный фактор Shh идентифицирован как ключевой индуктивный сигнал, который регулирует активность ZPA (Riddl et al 1993). Shh индуцирует фактор роста фибробластов 4 (FGF-4) в AER, который в свою очередь также регулирует экспрессию Shh и служит как эктодермальный компетентный фактор для подлежащей мезодермы реагирующей на Shh (Lauferr et al 1994). Эти индуктивные взаимодействия могут регулировать структурирование скелетного лимба на основании экспрессии структурных гомеобокс-генов в мезенхимальной почке лимба. Например Shh индуцирует локальную экспрессию hoxd 13 которая, как упоминалось выше, требуется для нормального структурирования лимба. Shh также индуцирует локальную экспрессию костного морфогеенетического протеина-2 (ВМР-2), трансформирующего ростового фактора бетта (TGF-бетта) относящегося к фактору с хряще индуцирующей активностью. Сходные индуктивные взаимодействия, похоже, играют важную роль в структурировании скелета в других зонах развивающегося эмбриона.

Локальный контроль формы кости.

Форма кости в течение роста.

Форма кости регулируется различными системными факторами. Рост скелета в конечном счете прекращается когда пластинка роста совершенно замещается костью, процесс который требует эстрогенов как у мужчин, так и у женщин (Federman 1994; Smith et al 1994). Темпы роста скелета определяются эпифизеальной пластинкой регулируемой гормоном роста, который выделяется гипофизом и действует преимущественно через локальную и системную экспрессию инсулино-подобного ростового фактора (IGF-1). Мыши имеющие низкий уровень IGF-1 в результате инактивации гена (Baker et al 1993) и люди с уменьшеным уровнем гормона роста, имели гипофизарный двартизм, заключающийся в редукции размеров скелета, но с незначительными изменениями пропорций между или внутри костей.

В течение роста размеры индивидуальных костей и относительные пропорции скелета сильно определяются комплексом процессов вовлекающих

множество местных медиаторов, как показано широким спектром клинических аномалий относящихся к диспропорциям роста скелета. В черепе интрамембранозные кости растут периферическим добавлением новой кости на остеогенных фронтах, котрорые образуются на линиях швов. Остеобластическая дифференцировка внутри швов и последующее отложение кости внутренне координируются с ростом черепа и закрытием швов. Дерегуляция координации приводит к зарастанию швов до созревания, проявляющееся в различных аномалиях черепа повсеместно известных как краниосиностозы. В кости, развитие которой базируется на хрящевых пластинках, энхондральная оссификация должна координироватся с симультанным ростом эпифизов, продольным ростом в эпифизеальных ростовых и радиальным ростом в периосте. Ахондроплазия наиболее частая причина человеческого двартизма, происходит от неполной координации этих процессов и характеризуется короткими, широкими костями и избыточным ростом периоста, относящегося к эпифизам.

По последним данным, клеточная сигнализация FGFs вовлечены в координацию пропорций роста кости. По крайней мере, не менее 9 членов семейства FGF взаимодействуют с 4-мя трансмембранными тирозинкиназными рецепторами FGF рецепторами, различающимися специфичностью и активностью, от FGFR1 до FGFR4. FGF рецепторная сигнализация регулирует различные клеточные процессы в основном не способные к дифференцировке и пролиферации мезенхимального или нейроэктодермального происхождения.

Недавно, несколько доминантных наследственых патологий скелета человека были связаны с мутациями FGF рецепторов. Мутация в трансмембранном регионе FGFR3 у пациентов с ахондроплазией показывает, что повреждение лиганд-рецепторной димеризации и сигнализации могут быть причиной этой болезни (Rousseau et al 1994; Shiking et al 1994). Экспрессия FGFR3 только в хондроцитах но не в периосте (Peters et al 1993) может объяснить, почему ахондроплазия приводит к аномалиям только в тех костях, развитие которых базируется на хрящевых пластинах, но не в интрамембранозных костя черепа. Краниосиностоз наблюдаемый при Crouson-синдроме связан с мутациями в экстрацеллюлярном домене FGFR2 которые могут нарушать связывание лиганда (Reardon et al 1994). Наконец пациенты с синдромом Pfeifer и синдромом Jackon-Weiss которые имеют как синостозы так и дефекты лимба, имеют сходные мутации в FGFR1 и FGFR2 соответственно (Jabs et al 1994; Muenke et al 1994). Неясно как различные точки мутаций FGFR2 дают много различных дефектов скелета при Кроузон и Джексон-Вейс синдромах. Идентификация этих мутаций при этих наследственных поражениях скелета выявляет локальную роль FGF медиаторной сигнализации в развитии скелета и способствует характеризации роли этих факторов в развитии скелета в трансгенных исследованиях.

Расщепление экспрессионных структур FGFR и их лигандов и даже эффектов FGF in vitro покозало, что специфичные FGF могут регулировать соотношения внутреннего роста различных зон эпифиза и во внутренней сети локальных гомеостатических взаимодействий FGF возможна интеграция с эффектами системных факторов контроля роста всего скелета и пропорций.

Дальнейшее понимание интеграции сигналов и коммуникации между различными зонами эпифизарной пластинки, можно получить из исследования паратироид гормон зависимого протеина (PTHrP). Несмотря на то, что PTHrP экспрессируется в различных зонах эпифиза, его рецепторы экспрессируются в хрящевой ростовой пластинке, локализуясь в основном в

транзитной зоне между пролиферирующими и гипертрофическими хондроцитами, показано что соотношения клеток в этой зоне регулируются созреванием хондроцитов. У мышей с инактивированным PTHrP геном имеется уменьшение пролиферации и преждевременная дифференцировка хондроцитов в эпифизарной пластине, вызывающее сильно увеличенное соотношение энхондральной оссификации, приводящее почти к полной оссификации скелета к моменту рождения (Amizuka et al 1994; Karaplis et al.,1994).

Недавно нашли, что будучи связанная с ростовым фактором сигнализирующим оконце роста, дистрофическая дисплазия, может быть вызвана дефектом гена для транспорта радикалов сульфатов (Hastbaska et al.,1994).

Структура кости, моделирование и ремоделирование.

Координация активностей остеокластов и остеобластов в резорбции и образовании, формирует внутреннюю структуру кости. В длинных костях, трубка компактной кости образует пространство для костного мозга и ограничивается двумя эпивизарными ростовыми пластинками. Полость костно

эти системные факторы вовлекают локальную регуляцию костного ремоделинга, до сих пор неизвестно. Недавний пример этой двойственности приводится всвязи с уменьшением плотности кости и общими аллелями гена

кодирующего рецептор витамина D (Morrison et al.,1994). Витамин стимулирует дифференцировку остеокластов и остеобластов in vitro, но какие изменения экспрессии его рецептора приводят к клеточным изменениям вызывающим остеопороз, остается неясным. Потенциальная плодотворность нового решения проблем, основывается наизучении многих паракринных ростовых и дифференцировочных факторов на моделях трансгенных мышей, основываясь на исследованиях на культурах клеток, вовлеченных в костный ремоделинг (см.ниже). Успех этой работы может быть связан с демонстрацией того, что у трансгенных мышей сверхэкспрессия интерлейкина-4 вызывает остеопороз, повреждая остеобластическую функцию (Lewis et al.,1993).

Роль колагенов.

Коллагены являются важными протеинами в костном и хрящевом матриксе и играют важную роль в детерминации размеров, формы и прочности этих тканей (обзор Van der Rest and Garrone,1991). Коллагены образют семейство из не менее 25 членов, некоторые из которых экспрессируются в определенном времени и месте в течение энхондрального формирования кости: коллаген II типа-протеин свойственный хрящу, коллаген Х типа главный протеин найденный в гипертрофическом хряще и коллаген I типа наиболее обильный протеин кости. Все колагены образуют глобулярные домены на амино- и карбоксильных концах и трех спиральный домен между. Новообразованные коллагеновые мономеры, ассоциируют в тримерные микрофибриллы, которые, однажды секретированные, агрегируют в большие структуры. Основываясь на этой структуре, колагены можно разделить на 6 различных категорий. Среди них фибриллярные колагены включающие типы I, II и XI; фибриллассоциированные коллагены включающие тип IX; и сетевые коллагены включающие коллаген Х типа. Недавняя характеристика мутаций коллагенов у мышей и людей, обеспечила понимание функций различных колагенов в хряще и кости (обзор Tylstra and Byers,1994).

Мутации коллагена II типа, гомотримера альфа 1 (II), кореллируют

с хондродисплазиями. Эта гетерогенная группа патологий хряща может

привести к двартизму, деформациям сочленений и другим ангомалия скеле-

та. Как и при мутации коллагена I типа, многие различные молекулярные

дефекты связанны с доминантными негативными мутациями, приводящими ко многим значительным дефектам в хрящевом развитии и структуре. Имеющиеся в распоряжении модели трнансгенных мышей с дефектами колагена II типа, должны помочь понять как мутации хряща воздействуют на последующее энхондральное формирование кости. Недавно, у пациента с повреждением хондрогенеза и с документированной доминантной негативной мутацией в альфа 1 (II) гене, была обнаружена экспрессия коллагена I типа в хондроцитах, показывающая возможность компенсаторного механизма при отсутствии экспрессии коллагена II типа (Freisinger et al.,1994).

Наконец коллаген Х, прототип короткой цепи коллагенов, экспрессируется исключительно в гипертрофических хондроцитах, где он формирует отдельное гексагональное окружение. Хотя его специфическая роль в гипертрофическом хряще неизвестна, он может служить субстратом для минерализации или сосудистой инвазии. Некоторое понимание его функции было получено через анализ трансгенных мышинных моделей и характеризации человеческих мутаций (Jacenko et al.,1994). Мыши с мутантным Х типом коллагена имеют сжатый гипертрофический хрящ пластинки роста и уменьшение образования кости в структурах соответствующих таковым при спондилометафизеальной дисплазии и метафизеальной хондродисплазии у людей. Последующий анализ подтвердил, что такая структура очевидно рождается мутацией коллагена Х типа, которая вся локализуется в карбокситерминальном нетриплетном домене протеина. Отсутствие детекции аномалий у мышей с инактивированным геном коллагена Х типа показывает, что другие коллагены могут компенсировать его отсутствие, и подчеркивает, что несовершенство аллелей коллагенов приводит к менее выраженному фенотипу, чем сверхэкспрессия доминантных негативных мутантов.