ОЛИГО- И ПОЛИНУКЛЕОТИДНЫЕ ЗОНДЫ
МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ.
А.Г.Бадашкеева, Д.Г.Кгорре, Моллек. Биол. Вып.2,т25 1991
Все многообразие живой природы первично основано на многообразии заложенных в живые организмы и вирусы генетических программ, иными словами – нуклеотидных последовательностей регуляторных и структурных областей всех генов, свойственных тому или иному живому
организму или вирусу. Наличие в биологическом образце определенных последовательностей может служить наиболее специфичным критерием присутствия в нем определенных генов. Выявить их можно путем гибридизации нуклеиновых кислот этого образца с зондами, представляющими собой поли- или олигонуклеотиды, последовательность которых комплементарна анализируемой. Такой метод анализа получил название метода молекулярной гибридизации (1-7), он быстро развивается в последние годы и используется как для исследовательских целей, так и для решения важных практических задач в первую очередь для медицинской и ветеринарной диагностики. Метод молекулярной гибридизации позволяет обнаружить в исследуемом образце вирусные последовательности или последовательности нуклеиновых кислот микроорганизмов, те или иные онкогены, позволяет выявить наследственные патологии. По своей уникальной специфичности метод, по меньшей мере, не уступает более широко распространенным методам иммунохимического анализа, причем информация, полученная методом молекулярной гибридизации, в ряде случаев дополняет иммунохимические данные.Метод моллекулярной гибридизации складывается в основном из четырех этапов:
1, Подготовка образца, амплификация анализируемого генетического материала.
Методы получения исходного образца ДНК или РНК многообразны и зависят от того, из какого биологическог источника она выделяется - из геномной клонотеки, из живого обьекта, из биологической жидкости. Общее требование – сохранение исходного генетического материала, или, по крайней мере, достаточно крупных его фрагментов в ходе выделения.
Способы получения зондов в настоящее время хорошо разработаны. Как известно, зонд представляет собой поли- или олигонуклеотид, несущий в ряде случаев дополнительный фрагмент ненуклеиновой природы – репортерную группу, необходимую для детекции гибридизации. Нуклеотидный зонд может быть получен двумя основными путями. Во-первых , можно получить кДНК либо на детектируемой ДНК с помощью ДНК полимеразы, либо на детектируемой РНК с помощью обратной транскриптазы. В последнем случае, получив ДНК-копию в очень небольших количествах, можно размножить ее, используя технику клонирования, в составе какой либо бактерии, например Е. Со
li (20).В составе плазмиды находится двунитиевая ДНК, поэтому перед использованием зонд подвергают денатурации, т.е. нагреванию или обработке органическим растворителем (формамидом). Однаков последующем неизбежно происходит частичное воссоединение этих участков, от степени которого в существенной мере зависит эффективность работы зонда. Степень ренатурации очень чувствительна к условям обработки зонда, что снижает воспроизводимость метода. Поэтому лучше использовать однонитевые зонды.
Из полинуклеотидных зондов используют зонды, встроенные в однонитиевую ДНК бактериофага М 13 (21). После размножения их в составе фага с помощью ДНК полимеразы 1 можно превратить ДНК в частично двунитиевую структуру. Это нетрудно сделать, не задевая фрагмент ДНК, содержащий
вмонтированный зонд. Для этого нужно ввести в систему затравочный олигонуклеотид, комплементарный фрагменту ДНК фага, расположенному от зонда в сторону от 3’ к 5’ концу: ДНК полимераза будет катализировать удлинение затравки в сторону, противоположную зондовой последовательности.Другой перспективный вариант получения однонитиевых зондов основан на синтезе РНК с помощью РНК-полимераз бактериофагов SP6 и T7 на двунитиевой матрице, содержащей необходимую последовательность (22-24). Преимуществом РНК-зондов является более высокая стабильность дуплексов ДНК-РНК, чем ДНК-ДНК.
Еще один путь получения олигонуклеотидных зондов с последовательностью комплементарной к исследуемому участку детектируемой нуклеиновой кислоты – это химический синтез. Наиболее широко используют фосфатамидный метод основанный на применении мономеров общей формулы (1) (25).
В соединении I DMTr – бис (n-метокси) трифенилметил, В – гетероцикл с защищенными экзоциклическими аминогруппами.
Использование олигонуклеотидных зондов возможно в том случае , если известна первичная структура детектируемой НК или по крайней мере значительной ее части. Достояинством таких зондов является значительно большая скорость их гибридизации с мишенью и легкость введения (иногда в ходе синтеза) в синтетические олигонуклеотиды группировок, необходимых для последующего введения молекул, обеспечивающих дальнейшую детекцию зонда.