Микроорганизмы и антибиотики. Алгоритмы и методы.
А) твердофазный скрининговый метод позволяет одновременно тестировать несколько изолятов или проб на несколько антибиотиков, позволяет проводить полуколичественный учет. Есть модификация позволяющая расчитывать теоретическую концентрацию того или иного антибиотика у границы зоны задержки роста. Для этой цели предложен и испытан тест штамм и специальная форма образцов антибактериальных веществ.
Б) жидкофазный метод проводится с использованием микротитровальной пластины. Учет результатов качественный, либо количественный с использованием спектрофотометра. Многократные замеры позволяют проводить построение кривых роста в присутствии тех или иных антибиотиков. Вы можете посмотреть пример испытания этой тест-системы в файле:
2) Скрининговый метод для определения синергичных комбинаций антибиотков.
Успешно испытан. Обладает простотой исполнения и дешевизной, система учета данных отличается оригинальностью (аналогов не обнаружено), но некоторые варианты математической обработки очень сложны. Например нами обнаружены синергичные комбинации бриллиантового зеленого и стрептомицина сульфата, толлуидинового синего и стрептомицина сульфата, толлуидинового синего и тиосульфата натрия.
2а) Дополнительно создан метод определения оптимального соотношения синергичных антибактериальных веществ.
Ввиду своей дешевизны и технологичности метод может быть использован в клинической практике. Но мы намерены проводить скрининговые исследования рассматривая результаты, как предварительные данные, которые бы позволили фармакологам сужать круг поиска при использовании традиционных методов.
Предложено и испытано несколько модификаций.
3а. Позволяет испытывать ферменты из нескольких проб с одним антибиотиком.
3б. Позволяет испытывать ферменты из одной пробы на несколько антибиотиков.
3в. Метод для клинической практики позволяет испытывать сразу несколько проб и несколько антибиотиков.
3г Метод позволяющий проводить разделение ферментов по молекулярной массе (скрининговый вариант, для научных работников).
Алгоритмы использования.
Как комплексно, так и по отдельности, разработанные нами методы, могут использоваться, для решения практических и теоретических задач. Например использование метода определение антибиотико-чувствительности и метода определения антибиотико-разрушающей активности позволило вылечить пиометру осложненную перитонитом у собаки с сердечно-сосудистой недостаточностью. Использование метода синергичных комбинаций позволило выявить несколько сочетаний, испытав около 20 веществ с использованием 2-х наборов. Мы активно сочетаем наши методы с рутинными методами бактериологических исследований. Тем не менее, выполняя рутинную работу мы пользуемся приемами, появившимися в биотехнологии и генной инженерии, некоторыми собственными находками. Мы выделяем 3 направления использования наших тест-систем: клиническая практика, скрининговые исследования с целью поиска новых антибактеральных препаратов и изучения показаний для их применения, научные исследования.
В клинической практике наиболее реально использование всего комплекса методов в крупных хозяйствах, но отдельные элементы комплекса достаточно дешевы и экономичны, для использования в лечении мелких домашних животных.
Мы считаем, что в ряде случаев к бактериологическому исследованию следут подходить прагматически. Рассматривать результаты следует через призму их влияния на действия врача, исходя из этого следует определять и задачи бактериологического исследования.
Высокая штаммовая вариабельность патогенности внутри вида, наличие мобильных генетических детерминант патогенности и антибиотикоустойчивости, различная способность разных видов бактерий к росту на разных питательных средах, высокая активность межвидового взаимодействия, в ряде случаев, снижают ценность определения видового состава микрофлоры.
Мы считаем необходимым определение факторов патогенности микрофлоры, механизмов защиты от антибактериальных препаратов и чувствительности к ним. Все остальное мы считаем целесообразным привязывать к этим данным и не более того. Разумеется это не относится к видам, обладающим высокой патогенностью и вирулентностью, но и не исключает дополнительного использования наших критериев.
Например, может возникнуть потребность разделения микрофлоры на составляющие компоненты, такое разделение мы проводим по функциональному признаку, но макро- и микро- морфология колоний позволяет облегчить этот процесс, служа дополнительным маркером.
Пример алгоритма получения максимальной информации о пробе посланной на бак. исследование
.
1 уровень
МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ
БИОПРОБА
ВЫСЕВ ГАЗОНА НА ТПС С ДИСКАМИ из зон задержек роста
биопробы,
различ колоний
АНТИБИОТИКО РАЗРУШАЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ, AНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫБОР ПРОБ НА СКРИНИНГ-ТЕСТА 1А,
. ИССЛЕДОВАНИЕ
Результаты: функциональные составляющие микрофлоры, их роль в поддержании стабильности микрофлоры, антибиотико-чуствительность, антибиотико-резистентность, прогнозы формирования антибиотикорезистентности и подбор последоватльных схем антибиотикотерапии. Знание антибиотико-разрушающей активности составных частей микрофлоры и чувствительности к антибиотикам этих же частей, уже позволяет подбирать оптимальные сочетания антибиотиков.
Безусловно далеко не всегда необходимы развернутые исследования. Можно предложить последовательное усложнение анализа, до получения удовлетворительных результатов.
2 уровень.
Дальнейшие исседования могут включать отладку системы мониторингадля данного хозяйства.
Подбор синергичных сочетаний антибиотиков (например, с целью удешевления лечения).
Подбор оптимальных терапевтических концентраций, анализ токсического эффекта антибиотиков. Эпизоотологический анализ мобильности и тропизма функциональных компонентов микробиоценозов и разработка соответствующих рекомендаций.
пример сцепленности антибиотикорезистентности